lunes, 2 de marzo de 2009

CONTROL DE CALIDAD INTERNO EN MICROBIOLOGIA

CONTROL DE CALIDAD INTERNO EN MICROBIOLOGIA
I. INTRODUCCION

El laboratorio clínico de microbiología, requiere para su correcto funcionamiento un adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas en el recibo, manejo y reporte de especimenes clínicos. En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar metodologías relativas al cuidado del paciente.

En este contexto el control de calidad en Microbiología Clínica envuelve el monitoreo de los medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para asegurar una adecuada práctica en el aislamiento, identificación y caracterización de agentes etiológicos y su correspondiente prueba de susceptibilidad como una guía de la terapia.

Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de Procedimientos, validación de metodologías y equipos, el desarrollo de ciclos de educación continua, elementos de bioseguridad y una supervisión sobre los reportes generados.

En éste sentido se hace énfasis en la correcta valoración de las pruebas de laboratorio, los agentes causales de enfermedades, el conocimiento de la flora normal, la taxonomía bacteriana y la interpretación correcta de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.

El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo, que el producto final del trabajo tenga un grado aceptable de confiabilidad con los límites establecidos. Debido a que la mayoría de los resultados en microbiología son producto de interpretaciones y evaluación de reacciones bioquímicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen un gran valor, los cálculos de coeficientes de variación y desviaciones estándares que son parte de funciones analíticas, tienen poca aplicación en el laboratorio de microbiología.

II. JUSTIFICACIÓN

La calidad debe ser la guía en el que hacer diario de un laboratorio, porque asegura que los resultados generados sean confiables, reconocidos y aceptados. Es responsabilidad de la dirección del laboratorio establecer los mecanismos rutinarios de control de calidad y definir su frecuencia.
Existen dos tipos de control: un control interno llevado a cabo por el propio personal de laboratorio y un control externo donde la participación corresponde a personal ajeno al propio laboratorio.
Este último se hace utilizando materiales de referencia, que son enviados a los laboratorios que participan en la red de control de calidad.
La calidad del resultado depende, de un conjunto de factores que el laboratorio debe tratar de controlar, sin tener a veces, la posibilidad de intervención directa en algunos de esos factores tales como:

La justificación de la toma de una muestra.
La utilización de la técnica y del material apropiado para la toma de la muestra.
Las condiciones apropiadas para el transporte o el envío de la muestra (medios de transporte, temperatura, condiciones de espera).
La técnica apropiada para la siembra de la muestra (medios de cultivo, temperatura, factores de crecimiento, etc.).
La calidad de los medios utilizados, para que los resultados sean reproducibles.
Las pruebas de identificación idóneas, con buena sensibilidad (el uso rutinario de cepas de referencia).
La correcta interpretación de los resultados y su reporte adecuado por parte del personal.
La interpretación correcta de los resultados por parte del médico.

Para que los resultados obtenidos posean una buena calidad diagnóstica, deben contener los siguientes criterios:

Fiabilidad o exactitud lo cual se traduce en un resultado correcto. Para ello existen dos tipos de pruebas:
Pruebas cuantitativas: Se miden por el grado en que los resultados se acercan al valor verdadero. Ejemplo: Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los antibióticos “in vitro”.
Pruebas cualitativas: La exactitud se mide determinando si el resultado es correcto. Ejemplo: Identificación de agentes patógenos.
Reproducibilidad o precisión: Cuando se repite la prueba, se obtiene el mismo resultado. En pruebas microbiológicas, esto se dificulta por la falta de homogeneidad y estabilidad en una muestra clínica
Rapidez y eficiencia: capacidad de entregar rápidamente los resultados fidedignos.

La calidad de los resultados es afectada por los siguientes factores:

La capacitación del personal profesional.
La calidad de los materiales y equipos: dotación suficiente, preparación y mantenimiento apropiados.
El cumplimiento de las normas de bioseguridad
La transmisión oportuna de los resultados: boletas correctamente completadas, datos transcritos de manera legible.

III. OBJETIVOS

Implementar un programa de control interno de la calidad en el Laboratorio de Referencia Regional en Salud Publica de la DIRESA Lima.
Lograr una estandarización de los métodos y materiales empleados para el procesamiento de una muestra microbiológica.

IV. RESPONSABLES

Jefe o coordinación del servicio de microbiología ( Unidad, area )
Coordinación de control de calidad del servicio de microbiología


V. ACTIVIDADES

1. Control de calidad de medios de cultivo

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua del exterior, así como la formación de agua dentro de la botella como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorece el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de Ph y cambios en el color del medio.
Además la exposición a la luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo.

Teniendo en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura ambiente y protegidos contra la humedad y la luz.

Los medios elaborados en polvo tienen una vida útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios substanciales, tales como hidratación, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse.

Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo deshidratado, con el nombre del producto, nombre de la casa proveedora, número de control del frasco, fecha de expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco.

El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratación.
Se recomienda utilizar agua recién destilada o completamente desmineralizada y un erlenmeyer con capacidad del doble del medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenización al momento de servirlos.
Cuando se va a esterilizar el medio de cultivo, debe asegurarse en seguir las instrucciones de tiempo, presión y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos. Una temperatura de 121 °C , presión de 15 libras y un tiempo de esterilización de 15 minutos, son suficientes para la mayoría de los medios.
El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un baño maría, para
evitar la formación de agua de condensación.

Al ser vertidos en las placas Petri, evitar la formación de burbujas y coágulos.
Durante el proceso de servida, debe tomarse una muestra del medio para realizar el control de calidad por esterilidad y eficiencia.

El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su utilidad durante un periodo de tiempo.
El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios, sin embargo, aquellos que contienen Tioglicolato, deben guardarse a temperatura ambiente.
Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se aconseja que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas Petri almacenados así, deben mantenerse con el fondo hacia arriba.
Dado que los medios almacenados en refrigeración, cuando pasan a temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la superficie, se recomienda poner las placas Petri en la incubadora a 35°C por 2 horas, colocándolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie seca.
Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la individualidad de las colonias en el aislamiento o en los casos de pruebas de sensibilidad a los antibióticos en los que el exceso de agua puede afectar la dilución de las colonias y por ende la lectura del halo de inhibición.
Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.
Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domésticas o cepas control comerciales (ATCC).
Se debe guardar un libro de registro de los resultados obtenidos.
1.1 Control de esterilidad

Se controlara el 5 -10 % del lote de medios preparados a 35ºC por 48 horas, si el porcentaje de placas contaminadas es mayos al 10% se descartara el lote completo

1.2 Controles de eficacia

Controlar el crecimiento de las bacterias a evaluar y que muestre resultados aceptables en pruebas de sensibilidad, se utilizaran cepas ATCC

1.3 Control de pH:

Se controlara el pH del medio en cada lote de preparación, teniendo como rango de 7.2 a 7.4 despues de gelificar a temperatura ambiente

1.4 Profundidad del agar

El estandar es de 4 mm

Se utilizara un vernier o una aguja con la marca de la medida y probar en cuatro cuadrantes y el centro de la placa

· 60 – 70 ml de agar para placa de 150 mm
· 25 – 35 ml de agar para placas de 100 mm

1.5 Contenido de timidita

La excesiva cantidad de timidita puede revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimpetoprim.
Se debe de evaluar cada lote de Mueller Hinton utilizando una cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 o alternativamente Enterococcus faecalis ATCC 33186 confrontada con el disco de sulfatrimetropim de 25 ug el halo de inhibición debe ser mayos a 20mm



1.6 Contenido de calcio, magnesio

Estándar: calcio ++ :20 – 25 mg/L
Magnesio ++ :10 – 12.5 mg/L

Concentraciones mayores a estos afectaran:

· Colistin y tetraciclinas: Aumentaran su actividad
· Aminoglucosidos: Disminuyen su actividad

Exceso de Zinc afecta a:

· Carbapenem el cual disminuye su actividad

Cepa control:

· Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 se enfrentara con disco de gentamicina de 10ug, el halo de inhibición debe ser de 16 a 21 mm

1.7 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

1.8 Periocidad del control:

Cada vez que se prepare un lote de medios de Cultivo.

1.9 Procedimientos y acciones correctivas ante dificultades con la calidad de los medios

1.9.1 Contaminación de las placas de cultivo:
· Realizar descontaminación del área de trabajo
· Realizar el control de contaminación de la incubadora, tal como se describe en el manual de microbiología del Laboratorio de Referencia Regional de la DIRESA LIMA
· Verificar el buen uso del autoclave

1.9.2 Acción correctiva en relación al pH:

· Si el pH del medio de cultivo no esta en el rango requerido, debe ser ajustado dependiendo del caso con soluciones estériles de ClNa 0,1normal ò HCl 0,1 normal
· Medir el Ph por encima de los 25°C.
· Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a 50°C.
· Solución incompleta del medio.
· Mala calidad del agua.
· Recipiente mal lavado o con residuos químicos.
· Mala conservación del medio deshidratado o vencido

1.9.3 Contenido de timidita

Si existe concentraciones elevadas de timidita se deberá corregir añadiendo plasma de caballo al 3%, esto eliminara el excedente ya que el plasma contiene timidita fosforilada

1.9.4 Contenido de calcio y magnesio

Se deberá de verificar la cantidad de cationes divalentes en el inserto del frasco muy independiente de la verificación práctica, en el caso que exceda la cantidad máxima permitida se deberá de rechazar el frasco de medio de cultivo.

1.9.5 Turbidez o precipitación :

· Mala calidad del agua.
· Sobrecalentamiento.
· Ph incorrecto.
· Solución incompleta.

1.9.6 Oscurecimiento :

· Sobrecalentamiento.
· Solución incompleta.
· Alteración del Ph.

1.9.7 Gel blando :

· Bajo porcentaje de agar en el medio.
· Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
· Sobrecalentamiento.
· Mala homogenización del medio.
· Exceso de agua.

1.9.8 Crecimiento bacteriano pobre :

· Exceso de calentamiento.
· Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
· Alteración en el Ph.

1.10 Registro:

Anexo 1

2. Control de calidad de tubos con medios bioquímicos

El control de calidad de los tubos Bioquímicas se deberá realizar usando cepas ATCC, esperando obtener los resultados que se observan en la tabla:

TSI E. coli ácido/ácido
TSI Shigella flexnerii alcalino/ácido
TSI Pseudomona aeruginosa alcalino/alcalino
SIM Proteus mirabilis movilidad positiva
SIM K. pneumoniae movilidad negativa
Citrato K.pneumoniae color azul. Crece
Citrato de Simmons E. coli Color verde no crece.
Caldo de urea Proteus Rojo-Morado. Positivo.
Caldo de urea E. coli Color Naranja. Negativo.

2.1 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

2.2 Periocidad del control:

Cada vez que se prepare un lote de medios de Cultivo.

2.3 Procedimientos y acciones correctivas ante dificultades con la calidad de los medios bioquímicas.

2.3.1 Contaminación de las tubos de cultivo:

· Realizar descontaminación del área de trabajo
· Realizar el control de contaminación de la incubadora, tal como se describe en el manual de microbiología del Laboratorio de Referencia Regional de la DIRESA LIMA
· Verificar la esterilización de los tubos colocando un papel indicador en cada esterilización del material

2.3.2 Acción correctiva en relación al pH:

· Si el pH del medio de cultivo no esta en el rango requerido, debe ser ajustado dependiendo del caso con soluciones estériles de ClNa 0,1normal ò HCl 0,1 normal

2.3.3 Calidad del medio

· Verificar la profundidad de los tubo el cual debe de tener 3.5 cm y la cuña de 2.5 cm de largo
· Medios que no estén fuera de la fecha de vencimiento

2.4 REGISTRO

ANEXO 2


3. CONTROL DE CALIDAD DE IDENTIFICACION

3.1 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

3.1 Periocidad del control:

El control de calidad de la identificación microbiológica se realizara bimestralmente, en el cual estará comprendida la identificación de especie, género y reacciones bioquímicas.

3.2 Procedimientos y acciones correctivas ante dificultades con la identificación

3.2.1 Reacción Bioquímica inadecuada:

· Verificar la reacción del control de calidad de los medios en tubo

3.2.2 Problemas con las cepas a estudiar

· Verificar que las cepas estén controladas y no estén muy deterioradas (envejecidas)

3.2.3 Control de calidad de pureza y viabilidad:

Este control se realizara a diferentes niveles del proceso; a simismo, se desempeñara cada vez que se realice un replique. con el fin asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.


3.3 REGISTRO

ANEXO 3


CONTROL DE CALIDAD DE ANTIBIOGRAMA

4.1 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

4.2 Periocidad del control:

El control de calidad de la susceptibilidad antimicrobiana se realizara diariamente por 30 días, en el cual se verificara que los diámetros obtenidos no estén fuera de los diámetros permitidos.

4.3 Procedimientos y acciones correctivas ante dificultades con la susceptibilidad

Procedimientos:

4.3.1 Control Diario:

Para cada combinación bacteria/antimicrobiano solo uno de cada 20 ensayos consecutivos puede estar fuera de los limites permitidos, caso contrario se requiere acciones correctivas

4.3.2 Control semanal:

· Primero se deberá demostrar una eficiencia satisfactoria para las pruebas diarias
· Para pasar del control diario al semanal, no mas de tres de cada 30 diametros de inhibición obtenidos diariamente puede estar fuera de los limites aceptables para cada combinación bacteria/antimicrobiano
· Continuar con el control de calidad u a vez por semana y cada vez que se cambie algún reactivo .




PROTOCOLO DE CONTROL DE CALIDAD DIARIO
PRUEBA DIARIA
1/20 Fuera Del Rango aceptable
Acciones correctivas
Repetir la prueba el mismo día
Continuar con las pruebas diarias
Razón: Error obvio
Resultados dentro del rango: continuar con las pruebas diarias
Acciones correctivas inmediatas
Repetir la prueba el mismo día por 5 días consecutivo
Resultados dentro del rango aceptable
Acciones correctivas adicionales
Investigar posible fuente del error
Continuar con las pruebas diarias
SI
NO
SI
NO
SI
NO




































PROTOCOLO DE CONTROL DE CALIDAD SEMANAL
Prueba Durante 30 Días Consecutivos
Razón: Error Obvio
Acciones correctivas adicionales
Repetir la prueba el mismo día
Continuar con las pruebas semanales
Al menos 1 de las pruebas semanales fuera del rango
Acciones correctivas
Repetir la prueba el mismo día por 5 días consecutivo
Acciones correctivas inmediatas
Investigar posible fuente del error
SI
NO
SI
NO
SI
NO
<=3/30 Resultados: fuera del rango aceptable Implementar controles semanales Resultado dentro el rango Continuar con las pruebas semanales Todos los resultados dentro del rango aceptable Continuar con las pruebas semanales NO NO SI SI 4.3.3 Halos de inhibición fuera del rango permitido · Verificar la fecha de vencimiento de los discos. · Verificar la temperatura de almacenaje de los antimicrobianos. · Los discos deben ser almacenados a un temperatura entre –20 y +8°C. · Algunos discos, especialmente los de antibióticos ß-lactámicos deben guardarse congelados a -20°C. Solo los viales en uso deben mantenerse a temperatura de refrigeración · Profundidad del Agar mayor a 4 mm · Concentración del inoculo superior al 0.5 de Mc farland · Al sacarlos de la refrigeradora para su uso, espere a que los viales alcancen la temperatura ambiente por 1 a 2 horas. · Siempre utilice primero los viales con fecha de caducidad más próxima. · Siempre que un cartucho a sido extraido del paquete, éste debe guardarse en un desecador que cierre perfectamente. · Cuando se utilice el aparato dispensador que contiene los discos deberá mantenerse siempre refrigerado. · Los discos son colocados en el medio a una distancia de más de 24 mm del centro de uno al centro del otro. En todo caso no colocar más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 5 discos sobre la placa de 100 mm. · Procurar no colocar discos de antibióticos bactericidas ( Ej. Penicilina, Cefalosporinas, Aminoglicósidos, Vancomicina ) al lado de antibióticos bacteriostáticos ( Ej. Cloranfenicol, Tetraciclina, Sulfonamidas ) para evitar el antagonismo antibiótico. · Colocar las placas en la incubadora dentro de los 15 primeros minutos después de su aplicación. · Para verificar el estado de los discos de sensibilidad, utilice cepas control ATCC, las cuales son seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en el método utilizado. Estas cepas se corren como una muestra más y se correlaciona el tamaño de los halos de inhibición con las medidas expresadas en los Manuales NCCLS M2-A6.

4.3.4 Halos de inhibición que presentan resistencia

· Verificar si la cepa estudiada presenta enzimas de resistencia a antibióticos ya sea betalactamicos, carbapenemasas, u otras resistencias

4.3.5 Problemas con las cepas a estudiar

· Verificar que las cepas estén controladas y no estén muy deterioradas (envejecidas)
· Verificar la reacción del control de calidad de los medios en tubo
· Verificar que las cepas estén controladas y no estén deterioradas (envejecidas)

4.3.6 El Estandar Mc farland:

· La densidad de la turbidez del Estándar McFarland deberá ser verificada utilizando un espectrofotómetro con dirección de luz de 1 cm y cubetas adecuadas para determinar absorbancia.
· Para realizar el control de un estándar McFarland de 0.5 , la absorbancia deberá leer entre 0.08 a 0.10 a una longitud de onda de 625 nm.
· Antes de ser usados, los patrones deberán agitarse para una adecuada homogenización.
· Mensualmente los patrones son descartados y vueltos a preparar, o en su defecto se debe comprobar su densidad.

4.3.7 Habituales causas de error en la prueba de susceptibilidad:

· Error administrativo en la transcripción de los datos del control de calidad.
· Lectura errónea al medir el diámetro de la zona.
· Contaminación u otros cambios en la cepa control.
· Suspensión del inóculo demasiado fuerte o demasiado débil.
· Mala agitación del estándar McFarland o estándar dañado.
· Incorrecta temperatura, tiempo o atmósfera de incubación.
· Perdida de la potencia del disco durante su transporte, su manejo o su almacenaje en el laboratorio.

4.3.8 Control de calidad de la lectura e interpretación:

· Cuando se va a determinar la sensibilidad del S. Pneumoniae a la Penicilina, utilizar un disco de Oxacilina de 1 µg.
· Las cepas de S. Pneumoniae con zonas de Oxacilina de >/- a 20 mm son susceptibles a penicilina ( CIM desarrollo de poca afinidad de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP’s) o a la producción de betalactamasa. Las pruebas de difusión en disco pueden detectar con exactitud los aislamientos que poseen alteradas las PBP’s , pero no detectarán con fiabilidad las cepas productoras de betalactamasa. Estas últimas han de detectarse con pruebas directas de betalactamasa ( Ej. Cefinasa ).
· Las placas han de leerse con luz transmitida para visualizar cualquiera pequeña colonia dentro del halo, que haría la cepa resistente.
· Todo caso de Estafilococo resistente a la Vancomicina, debe ser
· confirmado, enviado a un laboratorio de referencia e informar a las Autoridades de Salud Pública.
· Si se observan colonias dentro de un halo de inhibición, deberá confirmarse la pureza de la cepa y repetir la prueba.
· La difusión (" swarming ") de los Proteus sp no es inhibida por todos los antibióticos, por lo que no se toma en cuenta.
· Ocasionalmente se pueden observar varias colonias esparcidas por una zona de inhibición. Este fenómeno es constante para la Serratia sp las colonias se considerarán significativas y la cepa resistente
· Solo es necesario probar una Tetraciclina y sus resultados son equivalentes a la Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina.
· Los resultados obtenidos con al Polimixina, pueden aplicarse a la Colimicina. Su halo es pequeño debido a su pobre difusión en agar.
· Los Estafilococos resistentes a la Meticilina, Oxacilina o Nafcilina, también puede ser informados como resistentes a la Penicilina, Cefalosporinas , carbapenem y la Cefalotina puede utilizarse para representar Cefalotina, Cefradina Cefaclor y Cefadroxil
· Los datos de sensibilidad al ácido nalidíxico, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Sulfonamidas y Trimethoprim, se aplican solamente a cepas aisladas de infecciones urinarias.
· En cepas de Salmonella y Shigella, solo Ampicilina, una Quinolona y Trimethoprim/sulfametoxazol deben ser probados e informados de rutina en heces. Además el Cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación deben ser probados e informados en cepas de Salmonella sp extraintestinal.
· En cepas de Salmonella sp y Shigella sp, los aminoglicósidos y las cefalosporinas de primera y segunda generación, pueden aparecer como activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y no deben ser informados como susceptibles.
· La prueba de la betalactamasa predice la resistencia a la Penicilina, Ampicilina y Amoxicilina.
· En los Enterococos sp las cefalosporinas, los aminoglicósido ( Excepto por resistencia de nivel alto ) trimetropim / sulfametoxazole a clindamicina pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clínicamente y éstas cepas no deben informarse como susceptibles.

4.4 Registro:

ANEXO 4

CONTROL DE CALIDAD DE LA TINCIÓN

5.1 Procedimiento de control:

Se preparan portas de microscopio con una gota de una suspensión que contenga organismos Gram positivos y Gram negativos mezclados en diferentes proporciones.
Una vez seco, estas portas de microscopio pueden almacenarse para su empleo posterior como controles de la tinción Gram.

TINCION MICROORGANISMO REACCION ESPERADA
· Gram --- Estafilococo sp --- Morado--- Gram-Positivo.
· Gram --- E. coli --- Rosado--- Gram-Negativo.
· Gram --- Mezcla de ambos--- Mezcla de ambas colores.
· Zielh-Neelsen --- Mycobacterium sp --- Rosadas. ---BAAR positivo
· Zielh-Neelsen --- E. coli --- Azul. --- BAAR negativas.
· Verde malaquita --- Clostridium sp --- Espora de color verde.
· Verde malaquita --- E. coli --- Célula completa rosada.

5.2 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

5.3 Periocidad del control:

El control de calidad de los colorantes en microbiologia se realizara semanalmente, en la cual esta incluido la coloración Gram, coloración Giemsa, coloración Ziehl neelsen y otras coloraciones .

5.4 Procedimientos y acciones correctivas ante dificultades con la calidad de la tinción.

· El Violeta Cristal tiende a hacer precipitación, lo cual puede ser causa de observación de estructuras ficticias en el frotis. Si se observa precipitación, proceda a filtrar el tinte.
· La evaporación puede ser causa de mal funcionamiento de los tintes.
· Las placas que no han sido previamente limpiadas o con restos de grasa, pueden ser causa de mala fijación y tinción de la muestra.
· Sobrecalentamiento de la placa durante la fijación. El exceso de calor provoca un daño físico en la pared celular de las bacterias que puede afectar la retención de los colorantes.
· Lavado muy fuerte de la placa durante la tinción.
· Proporción no adecuada de los componentes de la tinción.
· Algunos tintes como Safranina y Fucsina básica pueden contaminarse. Si se sospecha esto , cultive 1 ml en Tioglicolato, o descarte el tinte.
· La tinción de Zielh-Neelsen tiene sus limitaciones en cuanto a no ser específica para micobacterias y su baja sensibilidad, ya que el nivel de detección es de 5,000 a 10,000 bacilos por mililitro de esputo. Esto debe ser tenido en cuenta al evaluar una placa.
· Una Cepa Control positiva, debe ser teñida cada vez que un nuevo lote de tintes para Zielh-Neelsen es preparado y cuando se reciba un nuevo pedido de tintes y reactivos. Se puede utilizar la cepa de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177 como control positivo.

5.5 Registro

Anexo 5

CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS DE LABORATORIO

Todos los instrumentos utilizados en el laboratorio clínico, deben estar amparados por un programa de control de calidad y de mantenimiento preventivo, basados en las instrucciones del fabricante y los procedimientos establecidos.

Un programa de mantenimiento preventivo es esencial para asegurar la exactitud y longevidad del instrumento. El chequeo periódico recomendado es importante para minimizar el daño o la necesidad de servicio y reparación. El jefe de laboratorio es responsable por el programa general, recayendo en el encargado de la sección la responsabilidad primaria en su área de trabajo.

6.1 Manual Estándar de Procedimientos Operacionales:

El Manual Estándar de Procedimientos Operacionales debe ser organizado por grupo de equipos.

Un listado de los equipos debe incluir: nombre, marca, modelo, número de serie, fecha de recibo y número de inventario de la institución.
El Manual debe incluir el récord de mantenimiento preventivo, periodicidad de la inspección y fallas del instrumento y debe estar accesible en todo momento.

6.2 Validación de Equipos:
Los nuevos equipos requieren estudios de validación para determinar que su funcionamiento es al menos comparables a los equipos existentes o a métodos de referencia. Estos equipos son aceptados solo si logran cumplir las metas mínimas de funcionabilidad y eficiencia al compararse con los existentes.
Este récord de validación debe mantenerse por toda la vida útil del equipo.
6.3 Manual de Instrucciones del Uso del Instrumento:
Estos Manuales deben estar incluidos en el Manual de Operaciones del instrumento, redactados en forma clara, en el idioma de los usuarios, inclusive la documentación del entrenamiento del personal.
Cada protocolo debe incluir precauciones de seguridad y los procedimientos de limpieza y cuidado del instrumento. Los Manuales deben incluir instrucciones básicas para resolver problemas menores y un récord de incidencias, que incluye el tipo de problema, los pasos tomados para resolverlo y la acción correctiva para evitarlo en el futuro.


6.4 Calibración del Instrumento:
Los equipos que requieren un exacto nivel de precisión para obtener un resultado seguro, requieren de una calibración periódica. La fecha de la calibración, frecuencia y resultado, deben ser mantenidos en un libro récord dentro del laboratorio.
6.5 Control de Calidad:
Todo equipo debe ser evaluado por un programa de Control de Calidad en base a las instrucciones del proveedor y las regulaciones internas del laboratorio. Debe mantenerse un libro récord de todo lo realizado al respecto, con el nombre del instrumento, fecha, resultado y comentarios. En otro capítulo se afianzarán los conceptos sobre éste tema.

6.6 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.


6.7 Periocidad del control:

El control de calidad de los equipos de laboratorio se realizara de acuerdo a las especificaciones del fabricante, según se detallara a continuación .

6.8 Procedimientos y acciones correctivas

6.8.1 INCUBADORAS:

· Se controlara diariamente la temperatura de las incubadoras, antes de sacar las placas y se anotara en una hoja control el resultado.
· Coloque las muestras, placas y tubos, en una posición segura.
· Un papel de filtro humedecido con agua en el fondo de la incubadora, es adecuado para mantener la humedad requerida.
· El encargado de sección debe ser notificado cuando una incubadora falla en mantener el rango de temperatura aceptable.
· Observe macroscópicamente las placas Petri para observar desecación.
· Todas las incubadoras deben ser limpiadas mensualmente y llevar un récord de mantenimiento preventivo.

6.8.2 AUTOCLAVES:
Frecuencia: Semanal
· Examine récord de Temperatura y Presión
· Utilice Indicadores de Esterilización
· Récord de uso, fecha, temperaturas, presión
· Chequeo del nivel de agua
· Uso de Indicadores biológicos de Esterilidad
· Chequeo de la válvula de seguridad
· Limpieza del Interior y Exterior.
· Limpieza de la Pantalla de Temperatura
· Limpieza del drenaje y sellos

6.8.3 REFRIGERADORAS:

Frecuencia: Diaria

· Coloque las placas Petri en posición invertida con la tapa hacia abajo.
· Mantenga la temperatura entre 4 – 8 ° C.
· Utilice refrigeradoras que no hacen escarcha.
· No coloque medios de cultivo aún ligeramente calientes dentro de la refrigeradora.
· Evite abrir con frecuencia la puerta de la refrigeradora.
· Lleve un registro de problemas de funcionamiento, causa y solución.
· No guarde alimentos en refrigeradoras para especímenes clínicos.

6.8.4 MICROSCOPIOS:
Cuidados y mantenimiento Diario Mensual Semestral
· Limpieza del aceite de objetivos, condensador, etc
· Apagar la fuente de luz
· Colocar cobertor contra el polvo
· Limpieza de Ocular, condensador, diafragma con líquido de limpieza de lentes
· Limpieza y ajuste del sistema óptico
· Limpieza y ajuste del sistema lumínico
· Limpieza y lubricación del sistema mecánico

6.8.5 CENTRÍFUGAS:
Frecuencia: Mensual
· Verificar tubos con rajaduras
· Verificar por restos de vidrio o líquido dentro del portatubo o las copas
· Verificar por balance de cada lote
· Verificar por la temperatura de funcionamiento ( Refrigeradas )
· Limpieza de cualquier derrame
· Limpieza de la olla del rotor
· Limpieza externa
· Desinfección de la olla del rotor
· Verificación de brochas
· Chequeo del circuito eléctrico
· Certificación del velocímetro
Problemas y Limitaciones:
Vibración
· Chequear por balance apropiado.
· Chequear tamaño de los tubos.
· Mirar si la centrífuga está sobre una superficie plana.


Rotura
· Chequear tamaño de los tubos.
· Balance correcto.
· Verificar el interior de los portatubos

Desprendimiento de tapas:
· Utilice tapas de rosca.
· Si no es posible, use Parafilm sobre los tapones de caucho.
· Siempre que sea posible utilice tubos de plástico.

6.8.6 ANALIZADOR DE PH:
Frecuencia: Diaria
Los analizadores de pH normalmente deben ser calibrados antes de ser utilizados, a fin de garantizar la calidad y exactitud de las lecturas. Los procedimientos que se realizan son los siguientes:
· Calibración de un punto. Se realiza en condiciones de funcionamiento y uso normal, Utiliza una solución de referencia de pH conocido.
· Calibración de dos puntos. Se realiza si se requiere efectuar mediciones muy precisas, utiliza dos soluciones de referencia de pH conocido, Igualmente, si el instrumento se utiliza de forma esporádica y si el mantenimiento que recibe es eventual.







Descripción del proceso
Tabla de solución de problemas:
PROBLEMA
CAUSA PROBABLE
SOLUCION


El analizador de pH presenta lecturas Inestables.
Burbujas de aire en el electrodo.
Remojar el electrodo para eliminar las burbujas.
Electrodo sucio.
Limpiar el electrodo y recalibrar.
Electrodo muy superficial.
Verificar que la muestra cubre perfectamentela punta del electrodo.
Electrodo roto.
Reemplazar el electrodo.
La respuesta del electrodo es lenta.
Electrodo sucio o grasoso
Limpiar el electrodo y recalibrar.
La pantalla presenta mensaje de error.
Operación incorrecta o selección errónea del modo de operación.
Verificar modo de operación seleccionado. Seleccionar una operación válida.

La pantalla presenta mensaje de calibración o error.
Error de calibración.
Recalibrar analizador de pH.
Valor de buffer erróneo en la calibración.
Verificar los valores del buffer utilizado.
Electrodo sucio.
Limpiar electrodo y calibrar.

6.8.7 BALANZA ELECTRONICA DIGITAL:

Frecuencia: Anual

Acción:
· Calibrar la balanza y documentar el proceso.
· Desensamblar y limpiar los componentes internos.
· Se debe seguir el proceso definido por el fabricante, o contratarse una firma especializada para el efecto.

Tabla de solución de problemas:

Problema
Causa del problema
Solución


La balanza no enciende.

Cable de interconexión desconectado o mal ajustado en la balanza.

Revisar conexión. Ajustar cable conector si es del caso.

La toma eléctrica sin corriente electrica

Verificar alimentación eléctrica.



La lectura del peso es incorrecta.

La balanza no fue puesta en cero antes de la lectura.

Colocar en cero la balanza; repetir la medida.

La balanza mal calibrada.

Calibrar de acuerdo con el procedimiento recomendado
por el fabricante.

La balanza desnivelada.

Nivelar la balanza.



La balanza no muestra en pantalla las unidades deseadas de medida.

Unidades mal seleccionadas.

Revisar el procedimiento definido por el fabricante para seleccionar la unidad de medida requerida.

La unidad requerida no habilitada.

Habilitar la unidad de medida de acuerdo al procedimiento definido por el fabricante.



La lectura de la balanza es inestable.

Vibración en la superficie del mesón.

Colocar la balanza sobre una superficie estable.

Puerta frontal de la balanza abierta.

Cerrar la puerta frontal para efectuar la medición.












6.8.8 HORNO DE CALOR SECO:

Frecuencia: Semanal

Tabla de solución de problemas:

Problema
Causa probable
Solución




No hay energía
La estufa no está conectada
Conectar estufa a toma eléctrica
El interruptor de encendido se encuentra apagado
Accionar el interruptor de encendido.

Disyuntor defectuoso
Cambiar el disyuntor.

Tarjeta de control defectuosa
Sustituir tarjeta de control.
Cable conector abierto
Revisar/reparar cables conectores
Temperatura errática elevada
Controlador defectuoso
Sustituir controlador


6.9 REGISTRO

Anexo 6

CONTROL DE CALIDAD DEL ANALISTA:

El personal es el factor más importante en la calidad del trabajo en el laboratorio de microbiología. El personal debe tener una dedicación y actitud positiva hacia el trabajo, capacidad académica, actualización constante y contar con los elementos indispensables para su labor

La competencia del personal de microbiología, debe ser certificada por la revisión de su hoja de trabajo, la interpretación de muestras desconocidas, su habilidad técnica.

7.1 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

7.2 Periocidad del control:

El control de calidad del personal a cargo del procesamiento de las muestras microbiológicas se realizara trimestralmente.

7.3 Procedimientos y acciones correctivas ante desviaciones en el procesamiento y resultados del analisis evaluado

Se realizara el control de calidad del analista por duplicidad de muestra, esto será de forma trimestral, en el cual se le entregara al personal a cargo del procesamiento una cantidad determinada de cepas para su identificación y susceptibilidad.

El reporte del resultado será entregado a los 15 días después de habérsele entregada el panel de evaluación.

Dichas cepas habrán sido estudiadas e identificadas por el personal a cargo de control de calidad del área de microbiología.

Acciones Correctivas:

Competencia técnica:

A) La dirección del laboratorio debe asegurar la competencia del personal que participa en la realización del ensayo, opera equipos, evalúa los resultados y firma los informes de ensayos.

B) Cuando emplea personal en formación debe proveer adecuada supervisión.

C) La dirección debe autorizar al personal que realiza una determinada tarea; como ser realizar muestreo, el ensayo, emitir el informe, operar equipos, realizar interpretaciones.

D) La dirección debe definir los requisitos mínimos de nivel de estudio, calificación y experiencias necesarias para las personas que ocupan puesto de trabajo clave en el laboratorio (perfiles de puesto) y mantenerlos actualizados.

E) La competencia del personal debe ser evaluada en forma continúa por ejemplo a través de controles de calidad, ensayos intralaboratorios e interlaboratorios,

F) La formación a ser adquirida deberá orientarse a garantizar la competencia en las técnicas y métodos realizados por el personal involucrado en el ensayo.

Capacitación del personal:

1. El personal deberá contar con conocimientos, experiencia y competencia de acuerdo a la tarea y responsabilidades que tenga asignadas.

2. Todo el personal técnico debe recibir un adecuado entrenamiento que incluyen técnicas básicas de microbiología como la manipulación en condiciones de esterilidad y adecuado criterio para dicha disciplina.
7.4 Registro:

Anexo 7

8 CONSERVACION DE CEPAS DE TRABAJO:

La mayoría de los procedimientos en Microbiología Clínica, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características morfológicas, fisiológicas y que sean típicas y reproducibles.

Para ayudar en este control, las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validación.

Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas aisladas de pacientes, es necesario tener un registro de la bacteria que incluye nombre, lugar de aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a los antibióticos, forma de almacenaje, fecha de último repique

En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos:

· Características típicas.
· Características estables.
· Reproducibilidad

8.1 Responsable:

Personal encargado del procesamiento de las muestras microbiológicas.

8.2 Periocidad del control:

El control de calidad de las cepas se realizara mensualmente




8.3 Procedimientos y acciones correctivas


Métodos de Conservación de Cepas Bacterianas:

8.3.1 Cultivo Stock
8.3.1.1 Ultracongelamieto:
Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo TSB conteniendo 10 a 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en pociones de 0.5 ml en pequeños tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45°C..
8.3.2 Cultivos Semi stock:
8.3.2.1 Congelamiento en congelador convencional:
Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre-10 a –25°C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelación y son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos de 6 a 12 meses.
8.3.2.2 Cultivo en CTA:
Se preparan tubos con rosca conteniendo Cisteína- Tripticasa y Soya agar. Inocular el cultivo puro y joven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeración, si es posible en la oscuridad.
Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un año y los fastidiosos por 6 meses.
8.3.2.3 Bacterias delicadas :
Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeración. Después de una serie de 6 transplantes consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.
8.3.2.4 Bacterias anaeróbicas:
Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado después de esterilizar por autoclave.
Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.
INDICADORES:

La evaluación de los resultados del control de calidad en sus diferentes aspectos se realizara mediante indicadores de estructura, proceso y resultado.

9.1 Indicador de estructura:

Numero de informes del programa de control de calidad durante el año evaluado:

· Meta: Se realizara 4 informes por año (informes trimestrales)
· Fuentes de verificación: Informes de control de calidad interno del laboratorio de microbiología presentados a la jefatura del laboratorio

9.2 Indicadores de proceso:
Numero de actividades del programa de control de calidad interno implementadas en el año.

· Meta: Ha implementado un mínimo de 3 actividades que incluyen el control de calidad de medios, tubos e identificación y susceptibilidad antimicrobiana

· Fuentes de verificación: Registros del control de calidad según actividad evaluada.

9.3 Indicadores de resultados:

% de concordancia en identificación:

· Meta: Mayor del 80% de concordancia en el primer año de implementado el programa de control de calidad interno.

· Fuente de verificación : Registro del control de calidad


% de concordancia en la interpretación de la susceptibilidad:

· Meta: Mayor del 80% de concordancia en el primer año de implementado el programa de control de calidad interno.

· Fuente de verificación : Registro del control de calidad















ANEXOS
Anexo 1
REGISTRO DE PREPARACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
Y OTROS

FECHA DE PREPARACIÓN ......./......./…....

MEDIO PREPARADO

MATERIA PRIMA
MARCA
LOTE N°
GRS/L
CANTIDAD TOTAL






pH medio preparado

CANTIDAD:_____________________ml N° TUBOS:_____________________ N° PLACAS:_______________

ESTERILIZACIÓN

AUTOCLAVE: ___________libras presión/tiempo

CONTROL DE CALIDAD

FECHA DE CONTROL DE CALIDAD ....../..../......

pH
Aspecto
Consistencia
Volumen
Esterilidad (24)
Esterilidad (48)













CONTROL DE CRECIMIENTO
Cepa Control
Satisfactorio
Insatisfactorio







CONTROL DE HEMOLISIS
Cepa Control
Beta
Alfa
Negativa









CONTROL DE INHIBICION
Cepa Control
Satisfactorio
Insatisfactorio







LOTE ACEPTADO: ________________ LOTE RECHAZADO: _______________

OBSERVACIONES: ___________________________________________________________________________

FIRMA PERSONA RESPONSABLE:_____________________________________________________________

Anexo 2
REGISTRO DE PREPARACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
EN TUBOS

FECHA DE PREPARACIÓN ......./......./…....

MEDIO PREPARADO
MATERIA PRIMA
MARCA
LOTE N°
GRS/L
CANTIDAD TOTAL











pH medio preparado :___________ pH medio preparado:________________

CANTIDAD:__________________ml CANTIDAD:__________________ml

N° TUBOS:___________________ N° TUBOS:___________________

ESTERILIZACIÓN
AUTOCLAVE: ___________libras presión/tiempo

CONTROL DE CALIDAD
FECHA DE CONTROL DE CALIDAD ....../..../......

MEDIO
pH
Aspecto
Consistencia
Volumen
Esterilidad (24)
Esterilidad (48)















CONTROL DE REACCION

Cepa Control
TSI
Reacción Esperada
LIA
Reacción Esperada
CITRATO
Reacción Esperada





























Cepa Control
SIM
Reacción Esperada
BILIS ESCULINA
Reacción Esperada

Reacción Esperada





























LOTE ACEPTADO: ________________ LOTE RECHAZADO: _______________

OBSERVACIONES: ___________________________________________________________________________

FIRMA PERSONA RESPONSABLE:_____________________________________________________________
Anexo 3
REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD EM IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS

CEPA N º...........

Institución:

Fecha de recepción de cepas: Fecha procesamiento:

1. IDENTIFICACION DE GENERO Y ESPECIE: PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBA
RESULTADO: +/-

PRUEBA
RESULTADO: +/-






























2. RESULTADOS

IDENTIFICACION FINAL DE LA CEPA No.


GENERO ESPECIE




ANALISTA:…………………………………………


Anexo 4

REGISTRO DE CONTROL DE CALIDAD DE DISCOS DE SENSIBILIDAD


FECHA:
RESPONSABLE:

E. coli S. aureus P. aeruginosa E.coli E. faecalis
MARCA LOTE F/V ATCC 25922 ATTC 25923 ATCC 28573 ATCC 35218 ATCC 29212
mm C.C mm mm C.C mm mm C.C mm mm C.C mm mm C.C mm
Amikacina 30 ug
Amoxicilina/ac clavul 20/10ug
Ampicilina 10 ug
Ampicilina/sulbactan 10/10ug
Aztreonam 30 ug 28-36 - 23-29 -
Carbenicilina 100 ug 23-29 - 18-24 -
Cefaclor 30 ug 23-27 27-31 - -
Cefazolina 30 ug 21-27 29-35 - -
Cefepime 30 ug 31-37 23-29 24-30 -
Cefixime 5ug 23-27 - - -
Cefoperazona/sulbactam 28-34 24-33 23-29 -
Cefotaxima 30ug 29-35 25-31 18-22 -
Cefoxitin 30 ug 23-29 23-29 - -
Ceftazidime 30 ug 25-32 16-20 22-29 -
Ceftriaxona 30 ug 29-35 22-28 17-23 -
Cefuroxima 30 ug 20-26 27-35 - -
Cefalotina 30 ug 15-21 29-37 - -
Cloranfenicol 30 ug 21-27 19-26 - -
Ciprofloxacina 5 ug 30-40 22-30 25-33 -
Clindamicina 2 ug 24-30 - -
Colistina 10 ug 11.-17 11.-17
Doxiciclina 30 ug 18-24 23-29
Eritromicina 15 ug - 22-30 - -
Fosfomicina 200ug 22-30 25-33 - -
Gentamicina 10ug 19-26 19-27 16-21 -
Imipenem 10ug 26-32 - 20-28 -
Levofloxacina 5 ug 29-37 25-30 19-26 -
Linezolid 30ug - 25-32 - -
Lomefloxacina 10 ug 27-33 23-29 22-28 -
Meropenem 10 ug 28-34 29-37 27-33 -
Ac nalidixico 30ug 22-28 - - -
Nitrofurantoina 300 20-25 18-22 - -
Norfloxacina 10 ug 28-35 17-28 22-29 -
Oxacilina 1ug - 18-24 - -
Penicilina 10 U - 26-37 - -
Polymyxin B 300 U 13-19 - 14-18
Rifampicina 5 ug 8-1O 26-34 - -
Sulfisoxazole 250ug o 300ug 15-23 24-34 - -
Teicoplanina 30 ug - 15-21 - -
Tetraciclina 30ug 18-25 24-30 - -
Ticarcilina 75 ug 24-30 - 21-27 6
Trimet/sulfamet 1.25/23.75ug 23-29 24-32 - - >=20 *
Vancomicina 30ug - 17-21 - -
Gentamicina (100 ug) - - - - 16-23
Estreptomicina (300 ug) - - - - 14 -20
Estreptomicina (10 ug) 12-20 14-22 -
Claritromicina 15 ug - 26-32 -
Ofloxacina 5 ug 29-33 24-28 17-21
Cefoperazona 30 ug 28-34 34-33 23-29
Meticilina 10 ug - 17-22 -
Mezlocilina 75 ug 23-29 - 19-25





Anexo 5

REGISTRO DE PREPARACIÓN Y CONTROL DE CALIDAD DE COLORANTES

FECHA DE PREPARACIÓN ......./......./…....

COLORANTE PREPARADO

MATERIA PRIMA
MARCA
LOTE N°
GRS/L
CANTIDAD TOTAL























CANTIDAD:_____________________ml



CONTROL DE CALIDAD

FECHA DE CONTROL DE CALIDAD ....../..../......


Lamina Control
Gram
Resultado Esperado
LAMINA 1


LAMINA 2


LAMINA 3


LAMINA 4



Lamina Control
Ziehl Neelsen
Resultado Esperado
LAMINA 5


LAMINA 6


LAMINA 7


LAMINA 8



ANEXO 6

FORMATO

LABORATORIO REFERENCIAL
DISA III
REGT N°
REGISTRO DE TEMPERATURA
Edición:
Pág. 1 de 1
EQUIPO
CODIGO
RANGO
AÑO
ESTUFA HERAEUS

35 A 37 ° C
2007
FECHA
INSTRUMENTO
(NTERNO-EXTERNO (CODIGO)
T° 1
T°2
RESPONSABLE
OBSERVACIONES













































































































TOTAL MENSUAL



TOTAL HORAS
DE USO



------------------------ --------------------------
Responsable Jefe de área

FORMATO

LABORATORIO REFERENCIAL
DISA III
REGT N°
REGISTRO DE TEMPERATURA
Edición:
Pág. 1 de 1
EQUIPO
CODIGO
RANGO
AÑO
REGRIGERADORA COLDEX

2-8 ° C
2007
FECHA
INSTRUMENTO
(NTERNO-EXTERNO (CODIGO)
T° 1
T°2
RESPONSABLE
OBSERVACIONES

























































































































TOTAL MENSUAL



TOTAL HORAS
DE USO



------------------------ --------------------------
Responsable Jefe de área



LABORATORIO REFERENCIAL
DISA III
REGT N°
USO DE AUTOCLAVE
ESTERILIZA S.A.
Edición:
Pág. 1 de 1
UBICACION
CODIGO
MES
AMB. ALTO RIESGO


FECHA
INICIO
TEMP
PRESIÓN
FIN
TOTAL
RESPONSABLE
OBSERVACIONES

































































































































TOTAL MENSUAL



TOTAL HORAS
DE USO



--------------------- -----------------------
Responsable Jefe de Área


LABORATORIO REFERENCIAL
DISA III
REGT N°
USO DE BALANZA ANALÍTICA OHAUS
Edición:1
Pág. 1 de 1
UBICACION
CODIGO
MES



FECHA
INICIO
FIN
TOTAL
RESPONSABLE
OBSERVACIONES





































































































































TOTAL MENSUAL



TOTAL HORAS
DE USO



------------------------ --------------------------
Responsable Jefe de área


LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL DISA III LIMA NORTE
REGT N°
USO DE CENTRÍFUGA MARATHÓN 21000
Edición:
Pág. 1 de 1
UBICACION
CODIGO
MES



FECHA
INICIO
FIN
TOTAL
RESPONSABLE
OBSERVACIONES











































































































































TOTAL MENSUAL



TOTAL HORAS
DE USO



------------------------ --------------------------
Responsable Jefe de área



LABORATORIO REFERENCIAL
DISA III
REGT N°
USO DEREGISTRO DEL HORNO
Edición: 1
Pág. 1 de 1
UBICACION

MES



FECHA
1ra LECT. Tº
2da. LECT. Tº
TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN (45 MINUTOS APROX.)
RESPONSABLE
OBSERVACIONES
HORA INICIO
HORA DE TÉRMINO






























































































TOTAL MENSUAL




TOTAL HORAS
DE USO


-------------------- ------------------
Responsable Jefe de Área

Anexo 7


Acción Correctiva



Nº Correlativo

Acta Comité de Calidad Nº


Fecha


Referencia



Causa
Acción de Mejoramiento
Implementación
Fecha
Responsable
(Nombre/Cargo/Firma)











Seguimiento / Cierre de la acción correctiva
Seguimiento de la acción correctiva
Fecha de seguimiento
Implantación
Nombre / Cargo / Firma
SI
NO













Comprobación de la eficacia de la acción de mejoramiento
Fecha de cierre
Fecha comprobación de eficacia
Grado de eficacia
Nombre y Firma
Encargado de calidad














MANUAL DE SUCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

MANUAL DE SUCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1. Objetivo:
El presente manual de procedimiento en microbiología tiene como objetivo ser un instrumento que determine las pautas que normalicen el procedimiento en la identificación y susceptibilidad de las cepas que ocasionan diversas patologías en la comunidad

2. Alcance:
La aplicación del presente manual se circunscribe para el Servicio de Microbiología del Laboratorio de Referencia Regional de la DIRESA LIMA.

3. Generalidades:
El control de calidad de un laboratorio implica un conjunto de medidas que garanticen la obtención de resultados confiables además de que abarquen los elementos que posibiliten la optimización del trabajo.

En este sentido el control de calidad tienen una influencia relevante en la identificación de las diversas cepas patógenas que afectan a la comunidad.

4. Responsabilidades:
El encargado del área es el responsable del cumplimiento y la puesta en practica del manual de procedimientos en microbiología.

5. Introducción

La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace más de dos décadas enfocados a normatizar el método.
El comité de expertos de la OMS. y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los países europeos.
Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretación de estas pruebas continúa siendo un tema de importantes esfuerzos internacionales.
Europa está dividida en varias regiones de influencia con diferentes sistemas de sensibilidad antimicrobiana:
El Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los países bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología y el Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos (CLSI).

En nuestro país y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las pautas del CLSI con algunas modificaciones.

El siguiente es un resumen de la metodología referida habitualmente como "Método de la OMS.", que no difiere substancialmente del conocido "Kirby- Bauer". Las tablas de interpretación fueron tomadas de las normas M2 – A7 del National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI)
El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión.

Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio.

El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo.

Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente.
El método recomendado por la CLSI (Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) se basa en los estudios de Bauer y colaboradores, este es el método descrito de manera más completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio.
El único método alternativo que ha sido estudiado adecuadamente y que demostró datos comparables de los diámetros de las zonas de inhibición, con precisión similar y correlación satisfactoria con la CIM, es la modificación de doble capa de Barry, García y Thrupp. Este método es una alternativa aceptable para la normalización del inóculo en las pruebas de sensibilidad de aislamientos de gérmenes patógenos de rápido crecimiento, como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa.

El método de doble capa en agar no es aplicable a las pruebas con otros microorganismos tales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc.

Las pruebas por cualquiera de los dos métodos pueden interpretarse con las mismas tablas de medida de los halos de inhibición si los resultados de las pruebas con las cepas controles se encuentran dentro de los rangos esperados.

6. Selección de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad

La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para el test de difusión, es una decisión de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1 y 1A enumeran los agentes de eficacia clínica probada para el tratamiento de infecciones por microorganismos que muestran una respuesta aceptable con las pruebas in Vitro.

Las consideraciones que se han considerado en la designación de un agente antimicrobiano a un grupo específico incluyen: eficacia clínica, prevalencia de resistencia, costo, recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos.

7. Descriptores:

Los antibióticos deberán ser referidos por su nombre genérico.

7.1 ß-Lactámicos

Los antibióticos ß-lactámicos poseen un anillo central de cuatro átomos denominado anillo ß-lactámico. Su principal modo de acción es la inhibición de la síntesis de pared celular.
El agregado de grupos sustituyentes al anillo ß-Lactámico u otras estructuras cíclicas adicionales determinan si el agente es una penicilina, una cefalosporina, un carbapenem o un monobactam.

7.2 Penicilinas

El espectro de las penicilinas está dirigido a bacterias no productoras de ß- Lactamasas Gram positivas, algunos fastidiosos y Gram negativos.
Las acilamino-penicilinas (ampicilina y amoxicilina) poseen actividad contra muchas especies Gram. Negativas, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de ß-lactamasas, las carboxipenicilinas
(carbenicilina y ticarcilina) y las ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina)

Poseen un amplio espectro contra Gram negativos incluyendo algunas especies de Pseudomonas. Las penicilinas resistentes a las penicilinasas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) poseen actividad contra gram positivos, inclusive los Staphylococcus productores de penicilinasas.

7.3 Combinación de ß-Lactámico / inhibidor de ß-Lactamasas

Esta combinación antimicrobiana incluye a una penicilina y un segundo agente que posee una actividad antibacteriana mínima pero funciona como inhibidor de algunas ß-lactamasas.

7.4 Cefalosporinas y otros Cephems

Las distintas cefalosporinas y cephems frecuentemente poseen un espectro de
actividad levemente diferente contra bacterias gram positivas y gram negativas.

Estos agentes son frecuentemente referidos como cefalosporinas de "primera", "segunda" o "tercera" generación, dependiendo en gran parte de su actividad frente a bacterias gram negativas con alto grado de resistencia.

Debido a las diferencias de actividad de algunos miembros de este grupo, deberían selecccionarse representantes de cada grupo para los test de rutina.

7.5 Carbapenemes

La estructura de los carbapenemes difiere levemente de la estructura de la penicilinas y son mucho más resistentes a la hidrólisis por las ß-lactamasas. Esta característica les provee un amplio espectro de actividad contra muchas bacterias gram negativas y gram positivas.

7.6 Monobactames

Los monobactames son estructuralmente los únicos antibióticos que muestran actividad sólo contra bacterias gram negativas aeróbicas. Hasta el momento, el aztreonam es el único monobactam aprobado para su uso por el USFDA.

7.7 Glicopéptidos

Los glicopéptidos poseen una compleja estructura química y actúan inhibiendo la síntesis de pared celular en un sitio diferente al de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo está dirigida a las bacterias gram positivas.

La vancomicina es aceptada para el tratamiento de infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alérgicos a la penicilina y también es útil para la terapia de infecciones debidas a especies bacterianas resistentes a ß- Lactámicos, Ejm: Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) y algunos enterococos.

7.8 Aminoglucósidos

Son un grupo de antibióticos de estructura similar que inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal. el espectro de actividad de los miembros de este grupo, está determinado por la existencia de enzimas bacterianas inactivantes de aminoglucósidos.

Pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gram negativos aeróbicos o en combinaciones sinérgicas (con antibióticos inhibidores de la síntesis de pared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, Ejm Enterococos.

7.9 Macrólidos

Los macrólidos son antibióticos estructuralmente relacionados que inhiben la síntesis proteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercado que podrían ser considerados para ensayar en bacterias gram positivas o en algunos gram negativos fastidiosos.

7.10 Tetraciclinas

Las tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal, de ciertas bacterias gram positivas y negativas. Las drogas de este grupo están relacionadas y salvo escasas excepciones, sólo la tetraciclina debería ser ensayada de rutina.

7.11 Quinolonas

Este grupo de compuestos incluye un número de agentes antimicrobianos íntimamente relacionados que funcionan primariamente inhibiendo la actividad de la DNA-girasa de muchas bacterias gram positivas y negativas. Diferencias sutiles en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensayen como agentes individuales.

7.12 Sulfonamidas y Trimetoprima

Este grupo de compuestos, abarcan varios agentes quimioterapéuticos con similar espectro de actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato.
El sulfisoxazol es la sulfonamida más comúnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lo tanto podría ser apropiada su selección para un test in-vitro. El sulfametoxazol es usualmente ensayado en combinación con trimetoprima, estos producen una inhibición secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias gram positivas y negativas.



Cepas con dificultades de crecimiento

Solo bacterias aeróbicas o facultativas que crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton sin suplementar podrían ser procesadas en este medio.

Para las pruebas con cepas que no crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton no suplementado (Ejm. S. pneumoniae, estreptococos Bhemolíticos y viridans) se adiciona sangre de oveja desfibrinada al medio fundido y enfriado, n una concentración final de 5 % (V/V).

Cuando la sangre se agrega al agar Mueller Hinton, los límites del control de oxacilina y meticilina serán levemente menores (2-3 mm.) a aquellos obtenidos con agar Mueller Hinton no suplementado. Esto podría resultar en zonas de inhibición menores a los límites aceptables con Staphylococcus aureus ATCC® 25923 definidos en la Tablas 3.

El agregado de sangre de carnero puede causar una fina película de crecimiento del microorganismo dentro de la zona de inhibición alrededor de los discos de sulfonamidas y trimetoprima. El agar chocolate no debe usarse para las pruebas con Haemophilus spp. El medio apropiado para este microorganismo es el agar HTM

Almacenamiento de los discos de ATB

Los discos de ATB deberán ser almacenados de la siguiente manera:
· Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC o menos, para mantener la droga en condiciones óptimas.
· Los discos que contienen drogas de la familia de antibióticos betalactámicos deben mantenerse en freezer para mantener su potencia. Los de pequeños stocks puedenmantenerse en el refrigerador.
· Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos.
· Cuando el indicador del desecador usado cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.
· Use solo los discos que no han sido calificados por sus fabricantes como vencidos.

Pautas para la selección del antimicrobiano

Para que una prueba de susceptibilidad sea práctica y relevante, el número de agentes antimicrobianos debería ser limitado.

En la tabla 1 y 2 se indica las drogas que deberían usarse de rutina en muchos laboratorios clínicos. La tabla esta dividida en columnas basadas en organismos específicos o grupos de organismos, y la variedad de drogas están indicadas por prioridad para realizar la prueba con el fin de ayudar al laboratorio en la selección de la prueba de rutina.

Se designan grupos de agentes comparables que generalmente no requieren ser duplicados en una prueba ya que la interpretación de los resultados es usualmente similar, y la eficacia clínica usualmente comparable.

La palabra "o" designa a grupos de agentes relacionados, los cuales muestran un espectro casi idéntico de actividad e interpretación de resultados, por esto, usualmente sólo uno de estos agentes necesita ser seleccionado para la prueba.

Pauta sugerida para Pruebas de Rutina, Selectivas e Informes

Grupo A

Los agentes de este grupo se consideran apropiados para incluirlos en la rutina, como panel primario de prueba por lo que el informe de rutina debe incluirlos todos.

Grupo B

Comprende agentes que son importantes clínicamente, particularmente para infecciones nosocomiales, ellos deben ser informados sólo selectivamente, cuando el organismo es resistente a agentes de la misma clase, en el Grupo A.

Grupo C

Comprende agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios que pueden requerir pruebas en aquellas instituciones que mostraron endemias o epidemias de cultivos resistentes a muchas drogas primarias (especialmente en la misma clase, por ejemplo ß-lactámicos o aminoglicósidos); para tratamiento de pacientes alérgicos a drogas primarias; para tratamiento de organismos inusuales (por ejemplo cloranfenicol para aislados extraintestinal de Salmonella spp algún Enterococcus resistente a vancomicina).

Grupo U

Nombra ciertos agentes antimicrobianos (por ejemplo Nitrofurantoina y algunas quinolonas), que están limitadas a tratamiento de infecciones del tracto urinario.

Estos agentes no son para ser probados contra patógenos recuperados de otro sitio de infección que no sea el tracto urinario.

Grupo O

Incluye agentes que tienen indicación clínica para el grupo de organismo pero no están indicados en los test de rutina.

Grupo Inv.

Incluye agentes que se están investigando y aún no han sido aprobados por la FDA.

Turbidez estándar para la preparación del inóculo

Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).

Para prepararlo proceda de la siguiente manera:

a. Prepare dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V).

b.Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0,08 - 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.

c. Distribuya 4 - 6 ml dentro de tubos similares a los que va a usar para preparar inóculos.

d.Mantenga los estándares guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz.

e. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea.

f. Reemplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.

Procedimiento para la realización del test de difusion por disco
13.1 Preparación del inóculo
13.1.1 Método de desarrollo previo

1. Seleccione 1 ó 2 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo.
2. Prepare una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo apropiado (Ejm: tripticasa de soya o agua destilada estéril) tocando la parte superior de cada colonia.
3. Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina o caldo hasta el tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland, por comparación visual con el estandar. Para ello, mire los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como contraste. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml
4. no debe de pasar más de 15 minutos desde la suspensión de la cepa problema hasta su sembrado en la placa de Mueller Hinton.































13.1.2 Inoculación de las placas

1. Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo.
2. Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.
3. Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse.
4. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.

13.1.3 Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas

1. Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.
2. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar.
3. No deben colocarse más de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 discos por placa de 100 mm.
4. Incubar las placas invertidas a 35ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus spp, las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada de CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando incubación ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibióticos.

13.1.4 Lectura de las placas e interpretación de resultados

1. Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo confluente.
2. Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos pueden leerse entre las 16-18 horas.
3. Use luz transmitida para examinar un ligero crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de inhibición.
4. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de meticilino o vancomicina resistencia.
5. Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretados con las Tabla 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H o 2I y los organismos se informarán sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado.



14 MICROORGANISMOS FASTIDIOSOS

14.1Haemophilus spp.
14.1.1 Medio

El medio de elección para la prueba de difusión por discos para Haemophilus spp es el Haemophilus Test Médium (HTM).

14.1.2 Procedimiento

· Realice una suspensión en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate incubada durante 20 - 24 horas. Ajuste a una turbidez equivalente al estándar 0,5 Mc Farland (1-4 X 108 UFC/ml). Debe tenerse cuidado de no preparar inóculos densos que puedan llevar a resultados falsos resistentes con cefalosporinas, especialmente cuando se trabaja con Haemophilus influenzae productores de Betalactamasa. hisope la placa de HTM dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
· No deberán aplicarse más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
· Las placas serán incubadas por 16-18 horas. en una atmósfera con 5% CO2 a 35ºC.
· En la lectura se debe considerar la zona de inhibición que no presente desarrollo obvio visible, un desarrollo débil o pequeñas colonias que podrían aparecer cercanas a la zona mas obvia de inhibición deberán ser ignoradas en la medición.




14.1.3 Interpretación

El criterio para la interpretación de la medida de los diámetros de halo están enumerados en la Tabla 2E. Los antibióticos que deben probarse para Haemophilus spp están enumerados en la Tabla 1A.

No se recomienda la prueba por difusión para Haemophilus spp con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A

14.2Neisseria gonorrhoeae

14.2.1 Medio

El medio recomendado para probar la sensibilidad de N. gonorrhoeae, es agar GC, autoclavado, con un 1 % de un suplemento de composición definida.

El agar chocolate enriquecido no es recomendado para determinar la sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae.

14.2.2 Procedimiento

1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 Mc Farland.
2. Hisope la placa dentro de los 15 min. de haber ajustado el inóculo.
3. No se deberán aplicar más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm cuando se prueben agentes que produzcan grandes zonas de inhibición (Ejm. quinolonas).
4. Las placas serán incubadas 20 - 24 horas a 35 ºC en atmósfera de CO2 (5 %).

14.2.3 Interpretación

Los antibióticos que deben probarse para N. gonorrhoeae están enumerados en la Tabla 1A. No se recomienda la prueba por difusión para N. gonorrhoeae con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A. La Tabla 2F nos brinda los detalles de criterios de interpretación. Los organismos con diámetros de halo <19 mm con discos de Penicilina de 10 UI generalmente son cepas productoras de ß-lactamasa.

Sin embargo, para el reconocimiento de esta resistencia plasmídica se prefiere la prueba de betalactamasa los microorganismos con resistencia plasmídica a la tetraciclina también muestran un diámetro < 19 mm (30 μg tetraciclina).

Por otra parte existen cepas resistentes a tetraciclina y penicilina por mecanismos cromosómicos que muestran diámetros de inhibición mayores; los cuales pueden ser adecuadamente reconocidas usando los criterios de interpretación indicados en la Tabla 2F.


14.3Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp.

14.3.1 Medio

El medio recomendado para Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp. es agar Mueller Hinton suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero. No son recomendados los medios preparados usando otras bases u otras clases de sangre.

14.3.2 Procedimiento

1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar sangre de carnero over night (16-18 hs.) y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 de Mc Farland. Hisope la placa dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
2. No se deberán de aplicars más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
3. Las placas serán incubadas a 35 ºC en atmósfera con 5 % de CO2. por 20 - 24 hs.



14.3.3 Interpretación

Los aislamientos de S. pneumoniae con zonas de inhibición para oxacilina >20 mm son considerados sensibles (CIMs < 0.06 μg) a penicilina. Zonas de inhibición < 19 mm pueden obtenerse con cepas resistentes, intermedias y ciertas cepas sensibles a penicilina.

Por lo tanto, todos aquellos aislamientos que presenten zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina (1 μg) se les debería determinar las CIMs a penicilina, meropenem y cefotaxima o ceftriaxona. S. pneumoniae no debe informarse como resistente o intermedio a penicilina en base solamente a zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina.

No se recomienda usar el disco de OXA (1μg) para determinar la susceptibilidad a penicilina en otros estreptococos distintos a S. pneumoniae.

El disco de penicilina o ampicilina puede ser usado para predecir la sensibilidad a estreptococos ß-hemolíticos, no así para estreptococos del grupo viridans. En aislamientos de S. viridans obtenidos de sitios normalmente estériles (Ejm. hueso, LCR, sangre, etc.), debería determinarse la CIM a penicilina. El test de difusión con penicilina (u OXA) no es apropiado para estreptococos del grupo viridans.

Los aislamientos de S. pneumoniae que dan >20mm con oxacilina son sensibles a penicilina y pueden ser considerados sensibles a ampicilina, amoxicilina, amoxicilina / ac. Clavulánico, ampicilina/ sulbactam, cefaclor, cefepime, cefetamet, cefixima, imipenem, y loracarbef por lo que esas drogas no requieren ser probadas.

No existen aún criterios apropiados de interpretación para el ensayo por difusión de la sensibilidad de algunos antimicrobianos útiles para el tratamiento de S. pneumoniae como amoxicilina, ampicilina, cefuroxima, cefepime, cefotaxima, ceftriazona, imipenem y meropenem. En estos casos se debe de realizar el CIM.


Puntos de corte para Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae
CIM ug/ml
S
I
R
Amoxicilina
No meningitis
≤ 2
4
≥ 8
Amoxicilina /Acido clavulanico
No meningitis
≤ 2/1
4/2
≥ 8/4

Los puntos de corte para cefotaxima, ceftriazona y cefepime se han reevaluado de acuerdo a la procedencia del microorganismo en “meningitis” o “no meningitis”

CIM
Ug/ml
Cefotaxima
Ceftriazona
Cefepime
S
I
R
S
I
R
S
I
R
Meningitis

≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
No meningitis
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4


14.4Detección de Estafilococos Resistentes
14.4.1 Meticilino/Oxacilino Resistencia

Históricamente se ha referido a “meticilino resistencia” como MRSA (para S. aureus meticilino resistente) o MRS (para estafilococo meticilino resistente) aún cuando la meticilina no ha sido desde hace tiempo el agente de elección ni para los test de sensibilidad ni para tratamiento. varios términos para referirnos a la resistencia a estos agentes: “MRS”, “meticilino resistencia” u “oxacilino resistencia”. Los problemas asociados con la detección de MRS continúan siendo estudiados por algunos laboratorios.
Para el mejor reconocimiento de estas cepas, deberán considerase los siguientes puntos:

· El disco de oxacilina en la prueba por difusión es más apropiado para detectar resistencia que el disco de meticilina o nafcilina. Por lo tanto se recomienda el uso del disco de oxacilina (1 μg) para la detección de meticilina/oxacilina resistencia.
· El inóculo se debe preparar a partir de una placa de 18 a 24 horas de incubación como se describe en la sección 5.1.2., sin preincubación.
· Los test para detectar MRS deben ser incubados por 24 hs. completas (no 16-18 hs.) a 35 ºC.
· Debe inspeccionarse cuidadosamente la zona alrededor del disco de OXA usando luz transmitida para poder así visualizar pequeñas colonias o la presencia de un fino desarrollo dentro de la zona de inhibición.
· La mayoría de los MRS son usualmente resistentes a múltiples antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia podría ser indicio de meticilino resistencia.
· Si el método de difusión por discos resultara dudoso con un posible Staphylococcus spp. meticilino resistente, deberán realizarse pruebas confirmatorias adicionales, tales como el test de screening en agar salado, según el documento M7 CLSI.
· Los S. aureus meticilino resistentes (MRSA) y S. coagulasa negativa meticilino resistentes deben informarse como resistentes a todos los cephems y los otros ßlactámicos, tales como amoxicilina/clavulánico, ampicilina/sulbactam, ticarcilina/clavulánico, piperacilina/tazobactam e imipenem, independientemente de los resultados in-vitro con estos agentes. Esto es debido a que la mayoría de los casos documentados de infecciones por MRSA han respondido pobremente a la terapia con ß-lactámicos o porque aún no se han presentado datos clínicos convincentes que documenten la eficacia clínica de estos agentes.

14.5Resistencia en Enterococcus spp.
14.5.1 Resistencia a Penicilina / Ampicilina

Los enterococos pueden ser resistentes a penicilina y ampicilina debido a la producción de proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) de baja afinidad o a la producción de ß-lactamasas.
El test de difusión por discos puede detectar adecuadamente aislamientos con PBPs alteradas, pero presenta resultados dudosos con cepas productoras de ß- lactamasas estas últimas pueden ser mejor detectadas mediante el uso de Nitrocefín

Ciertos enterococos penicilino o ampicilino resistentes pueden presentar alto nivel de resistencia (p.ej. CIM a penicilina > 128 μg/ml o ampicilina > 64 μg/ml). El test de difusión no diferencia aquellos aislamientos con resistencia normal de aquellos con alto nivel. El laboratorio debería determinar la CIM a penicilina o ampicilina para aquellos enterococos aislados de sangre y LCR, dado que E. faecium con bajo nivel de resistencia (penicilina < 64 μg/ml y ampicilina < 32 μg/ml) podrían ser potencialmente sensibles a la sinergia con un aminoglucósido (en el caso de ausencia de alto nivel de resistencia a aminoglucósidos), mientras que cepas con alto nivel de resistencia podrían ser resistentes a tal sinergia.

14.5.2 Resistencia a Vancomicina

Para la detección de enterococos resistentes a vancomicina mediante el método de difusión por discos se requiere que las placas sean incubadas por 24 hs. (en vez de 16 a 18 hs.), y que las zonas aparentes de inhibición con el disco de vancomicina sean cuidadosamente examinadas con luz transmitida para evidenciar pequeñas colonias o un tenue film de crecimiento dentro de la zona de inhibición. Si un enterococo de una infección severa es categorizado con resistencia intermedia a vancomicina según el método de difusión por discos, este resultado debe verificarse determinando la CIM a vancomicina según el documento M7 CLSI

14.5.3 Alto nivel de resistencia a aminoglucósidos

El alto nivel de resistencia a aminoglucósidos en enterococos predice que no se observará sinergia bactericida de penicilina o glicopéptidos con aminoglucósidos, como screening de este tipo de resistencia pueden usarse discos de alta carga de gentamicina (120 μg) y estreptomicina (300 μg). La ausencia de zonas de inhibición indican resistencia, y diámetros >10 mm son indicativos de ausencia de alto nivel de resistencia. Las cepas que presenten zonas de inhibición entre 7 y 9 mm deben verificarse usando el método de dilución según el documento M7. En la Tabla 3 se muestra como controlar los discos con altas cargas.

No es necesario probar otros aminoglucósidos porque sus actividades contra enterococo no son superiores a la gentamicina o la estreptomicina.



14.5.4 Detección de ß-lactamasas de espectro extendido en bacilos Gram Negativos

Las B-lactamasas de espectro extendido (ESBLs) son enzimas recientemente descriptas que provienen de mutaciones en genes que codifican B-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2 y SHV-1. Las ESBLs pueden conferir resistencia a cefotaxima, ceftacidima, aztreonam, penicilinas de espectro extendido y ß-lactámicos estructuralmente relacionados en aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, E. coli, y algunos otros géneros de la flia. Enterobacteriaceae que usualmente son sensibles a B-lactámicos de espectro extendido. Algunas ESBLs confieren resistencia a estos B-lactámicos y pueden ser facilmente detectadas por el test de difusión con discos (dan resistente o intermedio).

Otras, sin embargo, pueden mostrar bajo nivel de resistencia o solo podrían detectarse usando algún B-lactámico en particular. Estos últimos aislamientos podrían no alcanzar el valor de corte de resistencia según CLSI, a pesar de ser clínicamente resistentes a la terapia B-lactámica.

En aislamientos clínicos de Klebsiella spp. y E. coli con zonas de inhibición disminuidas a cefpodoxima, ceftacidima, aztreonam, cefotaxima, o ceftriaxona podría sospecharse la presencia de ESBLs. A estas cepas se les podría realizar el screening para detectar potenciales ESBL, usando el método descripto en la Tabla 2A.

En todas las cepas con ESBLs, los diámetros de las zonas inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam deberían aumentar en presencia de ac. Clavulánico (ver ESBL al final de la Tabla 2ª).

Todas las cepas productoras de ESBL, deberían ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam. Tabla 1 y 2A.







15 DETERMINACION DE ß-LACTAMASAS

15.1 Propósito

Una rápida determinación de ß-lactamasas brinda información clínica relevante mas tempranamente que el test de difusión por discos con Haemophilus spp., N. gonorrhoeae y Moraxella catarrhalis. Esta prueba es la única confiable para la detección de Enterococcus spp productores de ß-lactamasas.

Una determinación positiva de ß-lactamasas predice lo siguiente:

· Resistencia a penicilina, ampicilina y amoxicilina para Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, M catarrhalis; y resistencia a penicilina, acilamino, carboxy y ureidopenicilinas para Staphylococcus spp. y Enterococcus spp.
· Una determinación negativa de ß-lactamasa no descarta resistencia debido a otros mecanismos.
· No corresponde realizar la determinación de ß-lactamasas en Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. y otros bacilos gram negativos aeróbicos, dado que estos resultados no pueden predecir la susceptibilidad a los diferentes ß-lactámicos.


16 MICROORGANISMOS PROBLEMA

16.1 Detección de Resistencias en Staphylococcus spp.

161.1 Resistencia a meticilina u oxacilina

La resistencia a las penicilinas antiestafilococcicas resistentes a las ß-lactamasas se ha denominado históricamente meticilino resistencia. Es por eso que las siglas “MRSA” (methicillin-resistant S. aureus) o “MRS” (Methicillin-resistant staphylococci) se siguen utilizando aunque la meticilina ya no sea la droga de elección para la determinación de la sensibilidad o para el tratamiento.


En la actualidad algunos laboratorios continúan teniendo inconvenientes para la detección de MRS. Para mejorar la detección de estas cepas, se deben considerar los siguientes puntos:

a. Para detectar la meticilino resistencia se debe utilizar oxacilina, que es más adecuada que la meticilina o la nafcilina para este fin.
b. Para probar la sensibilidad a las penicilinas resistentes a penicilinasas (Ejm .oxacilina), tanto en las pruebas de dilución en agar como en caldo (ver Tabla 2C), se recomienda agregar al medio de cultivo ClNa 2% p/v.
c. El inóculo debe prepararse usando el método directo a partir de una placa de 24 horas y no el de crecimiento.
d. Las pruebas para la detección de meticilino resistencia se deben incubar a una temperatura de 33-35ºC (no superior a 35ºC) por un total de 24 hs (más que de 16-20 hs).
e. Se debe tener en cuenta que los estafilococos meticilino resistente son frecuentemente resistentes a otros antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia debe alertarnos sobre la posibilidad de meticilino resistencia.
f. Cuando el resultado de la CIM es dudoso con respecto a la posible meticilino-resistencia de un Staphylococcus spp. se recomienda realizar una prueba confirmatoria adicional como el “Screening” en placa suplementada con ClNa 2% p/v.
g. Tanto S. aureus como Staphylococcus coagulasa negativa meticilino resistentes, deben informarse resistentes a todos lo cefemes y otros ß-lactámicos tales como ampicilina / sulbactam, amoxicilina / clavulánico, ticarcilina / clavulánico, piperacilina / tazobactam e imipenem, independientemente del resultado de sensibilidad "in vitro".
h. Esto se debe a que hay muchos casos documentados de pobre respuesta al tratamiento de Staphylococcus meticilino resistentes (MRSA) con estas drogas y además no hay datos clínicos sobre la eficacia del tratamiento de los MRSA con ß-lactámicos.

17 DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXPANDIDO DE BACILOS GRAM NEGATIVO

Las ß-lactamasas de espectro expandido (BLEE o ESBLs) son enzimas cuyo origen proviene de mutaciones en genes que codifican ß-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2, y SHV-1. BLEEs puede conferir resistencia a cefotaxime, ceftazidine, aztreonam, penicilinas de espectro expandido, y ßlactamicos estructuralmente relacionadas a cepas aisladas en clínica de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, y unos pocos otros géneros de la familia Enterobacteriaceae que usualmente son susceptibles para ß-lactámicos de espectro extendido.

Algunos de estos aislamientos presentarán zonas de inhibición menores que la población normal sensible pero por encima del punto de corte de resistencia estándar para cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam..

En estos aislamientos se debe buscar la posible presencia de una ESBLs utilizando los puntos de corte listados en la tabla CLSI correspondiente.

En todos los aislamientos con BLEE los diámetros de las zonas de inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam se debe incrementar en presencia de ácido clavulánico. Todas las cepas productoras de BLEE deben ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam.


Screening y prueba confirmatoria de BLEE en K.pneumoniae, K.Oxytoca y E. coli en método de disco difusión

Método disco difusión
Screening Inicial
Test Fenotipico confirmatorio
Medio
Agar Mueller Hinton
Agar Mueller Hinton
Concentración de antimicrobianos en disco
Cefpodoximo 10 ug
Ceftazidina 30 ug
Aztreonam 30 ug
Cefotaxima 30 ug
Ceftriazona 30 ug





El uso de mas de un antimicrobiano, mejora la sensibilidad
Ceftazidina 30 ug
Ceftazidina / Acido clavulanico 30/10 ug

Y

Cefotaxima 30 ug
Cefotaxima / Acido clavulanico 30/10 ug


Los test confirmatorios requieren el uso de ambos cefotaximas y ceftazidima, solos y en combinación con acido clavulanico

Inoculo

Recomendaciones estándar de los sensidiscos
Condiciones de incubación
Duración de incubación
Resultados
Cefpodoximo ≤ 17 mm
Ceftazidina ≤ 22 mm
Aztreonam ≤ 27 mm
Cefotaxima ≤ 27 mm
Ceftriazona ≤ 25 mm

A ≥ 5 mm en el diámetro del halo para cualquiera de los agentes probados en combinación con ácido clavulanico versus su halo cuando es probado solo es igual a ESBL









Control de Calidad
E .coli ATCC 25922:

Cefpodoximo ≤ 23 – 28 mm
Ceftazidima ≤ 25-32 mm
Aztreonam ≤ 28-36 mm
Ceftriazona ≤ 29-35 mm
Cefotaxima ≤ 29-35 mm
E .coli ATCC 25922:

≤ 2 mm de diámetro en el halo del antimicrobiano probado solo versus la combinación con ácido clavulanico



Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
Cefpodoximo ≤ 9 – 16 mm
Ceftazidima ≤ 10-18 mm
Aztreonam ≤ 9-17 mm
Cefotaxima ≤ 17 -25 mm
Ceftriazona ≤ 16-24 mm


Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:

5 mm de aumento en el halo de ceftazidima con acido clavulanico.
≥ 3 mm de aumento en el diámetro del acido clavulanico con cefotaxima.





ANEXOS
Tabla 1A. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias no fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.
(Tabla 1, NCCLS Vol.22, Nº1 Enero 2002)


Enterobacteriaceae
Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.


GRUPO A
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina
Ceftazidima
Oxacilina
Penicilina o
ampicilina

Ceftazolina
Cefalotina
Gentamicina
Penicilina



Gentamicina
Mezlocilina o
Ticarcilina
Piperacillin

GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO

Amikacina
Amikacina


Azithromicina o clarithromicina o
Eritromicina


Linezolid

Amoxicilina /ácido clavulánico o ampicilina /sulbactam
Piperacilina / tazobactam
Ticarcilina / ácido clavulánico


Aztreonam
Cefoperazona


Quniupristin-Dalfopristin

Linezolid





Vancomicina

Cefamandole o Cefonicid o Cefuroxime
Clindamicina


Cefepime

Cefepime
Trimetoprim/ sulfametathoxazole

Cefmetazole
Cefoperazone
Cefotetan
Cefoxitin

Ciprofloxacina


Vancomicina


Cefotaxima
Ceftizoxima
Ceftriaxona
Imipenem o
Meropenem

Ciprofloxacina o
Levofloxacina


Tobramicnina



Imipenen o Meropenen

Mezlocilina o
Piperacilina / Ticarcilina

Trimetropin / Sulfametoxasol


GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO

Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa y acinetobacter spp
Staphylococcus spp
Enterococcus spp
Aztreonam
Ceftazidima ( ambos indicadores útiles de β-Lactámicos de espectro extendido)
Cefotaxima o Ceftriazona
Cloranfenicol
Gentamicina ( solo para detección de resistencia de alto nivel)
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Metilmicina
Estreptomicina (solo para deteccion de resistencia de alto nivel)
Kanamicina

Trimetropin / Sulfametoxazol
Ciprofloxacina o Levofloxacina o Ofloxacina o Gentifloxacina
Metilmicina
Gentamicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Tetraciclina
Rifampicina
(pueden ser probados para Enterococcus resistentes a vancomicina)
Tetraciclina
Rifampicina
Tobramicina
Tetraciclina
GRUPO U
SUPLEMENTARIO
SOLO TRACTO URINARIO

Carbenicilina
Carbenicilina
Lomefloxacina o
Norfloxacina
Ciprofloxacina
Levofloxacina
Norfloxacina
Cinoxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Ofloxacina
Ceftizoxima
Nitrofurantoina
Nitrofurantoina
Gatifloxacina
Loracarbef
Nitrofurantoina
Levofloxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Orfloxacina
Sulfisoxasole
Tetraciclina
Sulfisoxasole
Sulfisoxasole

Trimetropin
Trimetropin
Tetraciclina

Tabla 2. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.


Haemophilus spp.
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
distinto que
Streptococcus
pneumoniae
GRUPOA
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina

Eritromicina
Eritromicina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
Penicilina (disco de oxacilina)

Penicilina o ampicilina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO
Cefotaxima o ceftazidima o ceftizoxima o ceftriaxona

Clindamicina

Gatifloxacino o levofloxacina
Moxifloxacino o sparfloxacina
Ofloxacina
Cloranfenicol
Cefuroxima sódica (parenteral)
Tetraciclina
Clindamicina
Meropenem
Cloranfenicol
Meropenem
Vancomicina
Vancomicina
GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO
Azitromicina o claritromicina
Cefixima o cefotaxima o cefpodoxima o ceftizoxima o ceftriaxona
Cloranfenicol


Aztreonam
Linezolid

Cefaclor o cefprozil o loracarbef
Cefdinir o Cefixima o Cefpodoxima
Cefmetazole
Cefotetan
Cefoxitin
Cefuroxima
Rifampicina
Levofloxacina
Ofloxacina

Cefonicid
Linezolid
Acetil cefuroxima (oral)
Ciprofloxacina o grepafloxacina o ofloxacina
Quinupristin-Dalfopristin
Ciprofloxacina
Gatifloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Moxifloxacino
Ofloxacina
Esparfloxacina
Penicilina


Imipenen

Espectinomicina
Rifampicina
Tetraciclina
Tetraciclina