MANUAL DE SUCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1. Objetivo:
El presente manual de procedimiento en microbiología tiene como objetivo ser un instrumento que determine las pautas que normalicen el procedimiento en la identificación y susceptibilidad de las cepas que ocasionan diversas patologías en la comunidad
2. Alcance:
La aplicación del presente manual se circunscribe para el Servicio de Microbiología del Laboratorio de Referencia Regional de la DIRESA LIMA.
3. Generalidades:
El control de calidad de un laboratorio implica un conjunto de medidas que garanticen la obtención de resultados confiables además de que abarquen los elementos que posibiliten la optimización del trabajo.
En este sentido el control de calidad tienen una influencia relevante en la identificación de las diversas cepas patógenas que afectan a la comunidad.
4. Responsabilidades:
El encargado del área es el responsable del cumplimiento y la puesta en practica del manual de procedimientos en microbiología.
5. Introducción
La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace más de dos décadas enfocados a normatizar el método.
El comité de expertos de la OMS. y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los países europeos.
Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretación de estas pruebas continúa siendo un tema de importantes esfuerzos internacionales.
Europa está dividida en varias regiones de influencia con diferentes sistemas de sensibilidad antimicrobiana:
El Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los países bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología y el Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos (CLSI).
En nuestro país y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las pautas del CLSI con algunas modificaciones.
El siguiente es un resumen de la metodología referida habitualmente como "Método de la OMS.", que no difiere substancialmente del conocido "Kirby- Bauer". Las tablas de interpretación fueron tomadas de las normas M2 – A7 del National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI)
El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión.
Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio.
El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo.
Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente.
El método recomendado por la CLSI (Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) se basa en los estudios de Bauer y colaboradores, este es el método descrito de manera más completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio.
El único método alternativo que ha sido estudiado adecuadamente y que demostró datos comparables de los diámetros de las zonas de inhibición, con precisión similar y correlación satisfactoria con la CIM, es la modificación de doble capa de Barry, García y Thrupp. Este método es una alternativa aceptable para la normalización del inóculo en las pruebas de sensibilidad de aislamientos de gérmenes patógenos de rápido crecimiento, como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa.
El método de doble capa en agar no es aplicable a las pruebas con otros microorganismos tales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc.
Las pruebas por cualquiera de los dos métodos pueden interpretarse con las mismas tablas de medida de los halos de inhibición si los resultados de las pruebas con las cepas controles se encuentran dentro de los rangos esperados.
6. Selección de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad
La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para el test de difusión, es una decisión de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1 y 1A enumeran los agentes de eficacia clínica probada para el tratamiento de infecciones por microorganismos que muestran una respuesta aceptable con las pruebas in Vitro.
Las consideraciones que se han considerado en la designación de un agente antimicrobiano a un grupo específico incluyen: eficacia clínica, prevalencia de resistencia, costo, recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos.
7. Descriptores:
Los antibióticos deberán ser referidos por su nombre genérico.
7.1 ß-Lactámicos
Los antibióticos ß-lactámicos poseen un anillo central de cuatro átomos denominado anillo ß-lactámico. Su principal modo de acción es la inhibición de la síntesis de pared celular.
El agregado de grupos sustituyentes al anillo ß-Lactámico u otras estructuras cíclicas adicionales determinan si el agente es una penicilina, una cefalosporina, un carbapenem o un monobactam.
7.2 Penicilinas
El espectro de las penicilinas está dirigido a bacterias no productoras de ß- Lactamasas Gram positivas, algunos fastidiosos y Gram negativos.
Las acilamino-penicilinas (ampicilina y amoxicilina) poseen actividad contra muchas especies Gram. Negativas, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de ß-lactamasas, las carboxipenicilinas
(carbenicilina y ticarcilina) y las ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina)
Poseen un amplio espectro contra Gram negativos incluyendo algunas especies de Pseudomonas. Las penicilinas resistentes a las penicilinasas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) poseen actividad contra gram positivos, inclusive los Staphylococcus productores de penicilinasas.
7.3 Combinación de ß-Lactámico / inhibidor de ß-Lactamasas
Esta combinación antimicrobiana incluye a una penicilina y un segundo agente que posee una actividad antibacteriana mínima pero funciona como inhibidor de algunas ß-lactamasas.
7.4 Cefalosporinas y otros Cephems
Las distintas cefalosporinas y cephems frecuentemente poseen un espectro de
actividad levemente diferente contra bacterias gram positivas y gram negativas.
Estos agentes son frecuentemente referidos como cefalosporinas de "primera", "segunda" o "tercera" generación, dependiendo en gran parte de su actividad frente a bacterias gram negativas con alto grado de resistencia.
Debido a las diferencias de actividad de algunos miembros de este grupo, deberían selecccionarse representantes de cada grupo para los test de rutina.
7.5 Carbapenemes
La estructura de los carbapenemes difiere levemente de la estructura de la penicilinas y son mucho más resistentes a la hidrólisis por las ß-lactamasas. Esta característica les provee un amplio espectro de actividad contra muchas bacterias gram negativas y gram positivas.
7.6 Monobactames
Los monobactames son estructuralmente los únicos antibióticos que muestran actividad sólo contra bacterias gram negativas aeróbicas. Hasta el momento, el aztreonam es el único monobactam aprobado para su uso por el USFDA.
7.7 Glicopéptidos
Los glicopéptidos poseen una compleja estructura química y actúan inhibiendo la síntesis de pared celular en un sitio diferente al de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo está dirigida a las bacterias gram positivas.
La vancomicina es aceptada para el tratamiento de infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alérgicos a la penicilina y también es útil para la terapia de infecciones debidas a especies bacterianas resistentes a ß- Lactámicos, Ejm: Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) y algunos enterococos.
7.8 Aminoglucósidos
Son un grupo de antibióticos de estructura similar que inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal. el espectro de actividad de los miembros de este grupo, está determinado por la existencia de enzimas bacterianas inactivantes de aminoglucósidos.
Pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gram negativos aeróbicos o en combinaciones sinérgicas (con antibióticos inhibidores de la síntesis de pared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, Ejm Enterococos.
7.9 Macrólidos
Los macrólidos son antibióticos estructuralmente relacionados que inhiben la síntesis proteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercado que podrían ser considerados para ensayar en bacterias gram positivas o en algunos gram negativos fastidiosos.
7.10 Tetraciclinas
Las tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal, de ciertas bacterias gram positivas y negativas. Las drogas de este grupo están relacionadas y salvo escasas excepciones, sólo la tetraciclina debería ser ensayada de rutina.
7.11 Quinolonas
Este grupo de compuestos incluye un número de agentes antimicrobianos íntimamente relacionados que funcionan primariamente inhibiendo la actividad de la DNA-girasa de muchas bacterias gram positivas y negativas. Diferencias sutiles en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensayen como agentes individuales.
7.12 Sulfonamidas y Trimetoprima
Este grupo de compuestos, abarcan varios agentes quimioterapéuticos con similar espectro de actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato.
El sulfisoxazol es la sulfonamida más comúnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lo tanto podría ser apropiada su selección para un test in-vitro. El sulfametoxazol es usualmente ensayado en combinación con trimetoprima, estos producen una inhibición secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias gram positivas y negativas.
Cepas con dificultades de crecimiento
Solo bacterias aeróbicas o facultativas que crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton sin suplementar podrían ser procesadas en este medio.
Para las pruebas con cepas que no crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton no suplementado (Ejm. S. pneumoniae, estreptococos Bhemolíticos y viridans) se adiciona sangre de oveja desfibrinada al medio fundido y enfriado, n una concentración final de 5 % (V/V).
Cuando la sangre se agrega al agar Mueller Hinton, los límites del control de oxacilina y meticilina serán levemente menores (2-3 mm.) a aquellos obtenidos con agar Mueller Hinton no suplementado. Esto podría resultar en zonas de inhibición menores a los límites aceptables con Staphylococcus aureus ATCC® 25923 definidos en la Tablas 3.
El agregado de sangre de carnero puede causar una fina película de crecimiento del microorganismo dentro de la zona de inhibición alrededor de los discos de sulfonamidas y trimetoprima. El agar chocolate no debe usarse para las pruebas con Haemophilus spp. El medio apropiado para este microorganismo es el agar HTM
Almacenamiento de los discos de ATB
Los discos de ATB deberán ser almacenados de la siguiente manera:
· Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC o menos, para mantener la droga en condiciones óptimas.
· Los discos que contienen drogas de la familia de antibióticos betalactámicos deben mantenerse en freezer para mantener su potencia. Los de pequeños stocks puedenmantenerse en el refrigerador.
· Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos.
· Cuando el indicador del desecador usado cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.
· Use solo los discos que no han sido calificados por sus fabricantes como vencidos.
Pautas para la selección del antimicrobiano
Para que una prueba de susceptibilidad sea práctica y relevante, el número de agentes antimicrobianos debería ser limitado.
En la tabla 1 y 2 se indica las drogas que deberían usarse de rutina en muchos laboratorios clínicos. La tabla esta dividida en columnas basadas en organismos específicos o grupos de organismos, y la variedad de drogas están indicadas por prioridad para realizar la prueba con el fin de ayudar al laboratorio en la selección de la prueba de rutina.
Se designan grupos de agentes comparables que generalmente no requieren ser duplicados en una prueba ya que la interpretación de los resultados es usualmente similar, y la eficacia clínica usualmente comparable.
La palabra "o" designa a grupos de agentes relacionados, los cuales muestran un espectro casi idéntico de actividad e interpretación de resultados, por esto, usualmente sólo uno de estos agentes necesita ser seleccionado para la prueba.
Pauta sugerida para Pruebas de Rutina, Selectivas e Informes
Grupo A
Los agentes de este grupo se consideran apropiados para incluirlos en la rutina, como panel primario de prueba por lo que el informe de rutina debe incluirlos todos.
Grupo B
Comprende agentes que son importantes clínicamente, particularmente para infecciones nosocomiales, ellos deben ser informados sólo selectivamente, cuando el organismo es resistente a agentes de la misma clase, en el Grupo A.
Grupo C
Comprende agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios que pueden requerir pruebas en aquellas instituciones que mostraron endemias o epidemias de cultivos resistentes a muchas drogas primarias (especialmente en la misma clase, por ejemplo ß-lactámicos o aminoglicósidos); para tratamiento de pacientes alérgicos a drogas primarias; para tratamiento de organismos inusuales (por ejemplo cloranfenicol para aislados extraintestinal de Salmonella spp algún Enterococcus resistente a vancomicina).
Grupo U
Nombra ciertos agentes antimicrobianos (por ejemplo Nitrofurantoina y algunas quinolonas), que están limitadas a tratamiento de infecciones del tracto urinario.
Estos agentes no son para ser probados contra patógenos recuperados de otro sitio de infección que no sea el tracto urinario.
Grupo O
Incluye agentes que tienen indicación clínica para el grupo de organismo pero no están indicados en los test de rutina.
Grupo Inv.
Incluye agentes que se están investigando y aún no han sido aprobados por la FDA.
Turbidez estándar para la preparación del inóculo
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).
Para prepararlo proceda de la siguiente manera:
a. Prepare dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V).
b.Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0,08 - 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.
c. Distribuya 4 - 6 ml dentro de tubos similares a los que va a usar para preparar inóculos.
d.Mantenga los estándares guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz.
e. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea.
f. Reemplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.
Procedimiento para la realización del test de difusion por disco
13.1 Preparación del inóculo
13.1.1 Método de desarrollo previo
1. Seleccione 1 ó 2 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo.
2. Prepare una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo apropiado (Ejm: tripticasa de soya o agua destilada estéril) tocando la parte superior de cada colonia.
3. Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina o caldo hasta el tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland, por comparación visual con el estandar. Para ello, mire los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como contraste. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml
4. no debe de pasar más de 15 minutos desde la suspensión de la cepa problema hasta su sembrado en la placa de Mueller Hinton.
13.1.2 Inoculación de las placas
1. Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo.
2. Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.
3. Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse.
4. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.
13.1.3 Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas
1. Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.
2. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar.
3. No deben colocarse más de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 discos por placa de 100 mm.
4. Incubar las placas invertidas a 35ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus spp, las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada de CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando incubación ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibióticos.
13.1.4 Lectura de las placas e interpretación de resultados
1. Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo confluente.
2. Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos pueden leerse entre las 16-18 horas.
3. Use luz transmitida para examinar un ligero crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de inhibición.
4. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de meticilino o vancomicina resistencia.
5. Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretados con las Tabla 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H o 2I y los organismos se informarán sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado.
14 MICROORGANISMOS FASTIDIOSOS
14.1Haemophilus spp.
14.1.1 Medio
El medio de elección para la prueba de difusión por discos para Haemophilus spp es el Haemophilus Test Médium (HTM).
14.1.2 Procedimiento
· Realice una suspensión en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate incubada durante 20 - 24 horas. Ajuste a una turbidez equivalente al estándar 0,5 Mc Farland (1-4 X 108 UFC/ml). Debe tenerse cuidado de no preparar inóculos densos que puedan llevar a resultados falsos resistentes con cefalosporinas, especialmente cuando se trabaja con Haemophilus influenzae productores de Betalactamasa. hisope la placa de HTM dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
· No deberán aplicarse más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
· Las placas serán incubadas por 16-18 horas. en una atmósfera con 5% CO2 a 35ºC.
· En la lectura se debe considerar la zona de inhibición que no presente desarrollo obvio visible, un desarrollo débil o pequeñas colonias que podrían aparecer cercanas a la zona mas obvia de inhibición deberán ser ignoradas en la medición.
14.1.3 Interpretación
El criterio para la interpretación de la medida de los diámetros de halo están enumerados en la Tabla 2E. Los antibióticos que deben probarse para Haemophilus spp están enumerados en la Tabla 1A.
No se recomienda la prueba por difusión para Haemophilus spp con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A
14.2Neisseria gonorrhoeae
14.2.1 Medio
El medio recomendado para probar la sensibilidad de N. gonorrhoeae, es agar GC, autoclavado, con un 1 % de un suplemento de composición definida.
El agar chocolate enriquecido no es recomendado para determinar la sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae.
14.2.2 Procedimiento
1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 Mc Farland.
2. Hisope la placa dentro de los 15 min. de haber ajustado el inóculo.
3. No se deberán aplicar más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm cuando se prueben agentes que produzcan grandes zonas de inhibición (Ejm. quinolonas).
4. Las placas serán incubadas 20 - 24 horas a 35 ºC en atmósfera de CO2 (5 %).
14.2.3 Interpretación
Los antibióticos que deben probarse para N. gonorrhoeae están enumerados en la Tabla 1A. No se recomienda la prueba por difusión para N. gonorrhoeae con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A. La Tabla 2F nos brinda los detalles de criterios de interpretación. Los organismos con diámetros de halo <19 mm con discos de Penicilina de 10 UI generalmente son cepas productoras de ß-lactamasa.
Sin embargo, para el reconocimiento de esta resistencia plasmídica se prefiere la prueba de betalactamasa los microorganismos con resistencia plasmídica a la tetraciclina también muestran un diámetro < 19 mm (30 μg tetraciclina).
Por otra parte existen cepas resistentes a tetraciclina y penicilina por mecanismos cromosómicos que muestran diámetros de inhibición mayores; los cuales pueden ser adecuadamente reconocidas usando los criterios de interpretación indicados en la Tabla 2F.
14.3Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp.
14.3.1 Medio
El medio recomendado para Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp. es agar Mueller Hinton suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero. No son recomendados los medios preparados usando otras bases u otras clases de sangre.
14.3.2 Procedimiento
1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar sangre de carnero over night (16-18 hs.) y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 de Mc Farland. Hisope la placa dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
2. No se deberán de aplicars más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
3. Las placas serán incubadas a 35 ºC en atmósfera con 5 % de CO2. por 20 - 24 hs.
14.3.3 Interpretación
Los aislamientos de S. pneumoniae con zonas de inhibición para oxacilina >20 mm son considerados sensibles (CIMs < 0.06 μg) a penicilina. Zonas de inhibición < 19 mm pueden obtenerse con cepas resistentes, intermedias y ciertas cepas sensibles a penicilina.
Por lo tanto, todos aquellos aislamientos que presenten zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina (1 μg) se les debería determinar las CIMs a penicilina, meropenem y cefotaxima o ceftriaxona. S. pneumoniae no debe informarse como resistente o intermedio a penicilina en base solamente a zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina.
No se recomienda usar el disco de OXA (1μg) para determinar la susceptibilidad a penicilina en otros estreptococos distintos a S. pneumoniae.
El disco de penicilina o ampicilina puede ser usado para predecir la sensibilidad a estreptococos ß-hemolíticos, no así para estreptococos del grupo viridans. En aislamientos de S. viridans obtenidos de sitios normalmente estériles (Ejm. hueso, LCR, sangre, etc.), debería determinarse la CIM a penicilina. El test de difusión con penicilina (u OXA) no es apropiado para estreptococos del grupo viridans.
Los aislamientos de S. pneumoniae que dan >20mm con oxacilina son sensibles a penicilina y pueden ser considerados sensibles a ampicilina, amoxicilina, amoxicilina / ac. Clavulánico, ampicilina/ sulbactam, cefaclor, cefepime, cefetamet, cefixima, imipenem, y loracarbef por lo que esas drogas no requieren ser probadas.
No existen aún criterios apropiados de interpretación para el ensayo por difusión de la sensibilidad de algunos antimicrobianos útiles para el tratamiento de S. pneumoniae como amoxicilina, ampicilina, cefuroxima, cefepime, cefotaxima, ceftriazona, imipenem y meropenem. En estos casos se debe de realizar el CIM.
Puntos de corte para Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
CIM ug/ml
S
I
R
Amoxicilina
No meningitis
≤ 2
4
≥ 8
Amoxicilina /Acido clavulanico
No meningitis
≤ 2/1
4/2
≥ 8/4
Los puntos de corte para cefotaxima, ceftriazona y cefepime se han reevaluado de acuerdo a la procedencia del microorganismo en “meningitis” o “no meningitis”
CIM
Ug/ml
Cefotaxima
Ceftriazona
Cefepime
S
I
R
S
I
R
S
I
R
Meningitis
≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
No meningitis
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4
14.4Detección de Estafilococos Resistentes
14.4.1 Meticilino/Oxacilino Resistencia
Históricamente se ha referido a “meticilino resistencia” como MRSA (para S. aureus meticilino resistente) o MRS (para estafilococo meticilino resistente) aún cuando la meticilina no ha sido desde hace tiempo el agente de elección ni para los test de sensibilidad ni para tratamiento. varios términos para referirnos a la resistencia a estos agentes: “MRS”, “meticilino resistencia” u “oxacilino resistencia”. Los problemas asociados con la detección de MRS continúan siendo estudiados por algunos laboratorios.
Para el mejor reconocimiento de estas cepas, deberán considerase los siguientes puntos:
· El disco de oxacilina en la prueba por difusión es más apropiado para detectar resistencia que el disco de meticilina o nafcilina. Por lo tanto se recomienda el uso del disco de oxacilina (1 μg) para la detección de meticilina/oxacilina resistencia.
· El inóculo se debe preparar a partir de una placa de 18 a 24 horas de incubación como se describe en la sección 5.1.2., sin preincubación.
· Los test para detectar MRS deben ser incubados por 24 hs. completas (no 16-18 hs.) a 35 ºC.
· Debe inspeccionarse cuidadosamente la zona alrededor del disco de OXA usando luz transmitida para poder así visualizar pequeñas colonias o la presencia de un fino desarrollo dentro de la zona de inhibición.
· La mayoría de los MRS son usualmente resistentes a múltiples antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia podría ser indicio de meticilino resistencia.
· Si el método de difusión por discos resultara dudoso con un posible Staphylococcus spp. meticilino resistente, deberán realizarse pruebas confirmatorias adicionales, tales como el test de screening en agar salado, según el documento M7 CLSI.
· Los S. aureus meticilino resistentes (MRSA) y S. coagulasa negativa meticilino resistentes deben informarse como resistentes a todos los cephems y los otros ßlactámicos, tales como amoxicilina/clavulánico, ampicilina/sulbactam, ticarcilina/clavulánico, piperacilina/tazobactam e imipenem, independientemente de los resultados in-vitro con estos agentes. Esto es debido a que la mayoría de los casos documentados de infecciones por MRSA han respondido pobremente a la terapia con ß-lactámicos o porque aún no se han presentado datos clínicos convincentes que documenten la eficacia clínica de estos agentes.
14.5Resistencia en Enterococcus spp.
14.5.1 Resistencia a Penicilina / Ampicilina
Los enterococos pueden ser resistentes a penicilina y ampicilina debido a la producción de proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) de baja afinidad o a la producción de ß-lactamasas.
El test de difusión por discos puede detectar adecuadamente aislamientos con PBPs alteradas, pero presenta resultados dudosos con cepas productoras de ß- lactamasas estas últimas pueden ser mejor detectadas mediante el uso de Nitrocefín
Ciertos enterococos penicilino o ampicilino resistentes pueden presentar alto nivel de resistencia (p.ej. CIM a penicilina > 128 μg/ml o ampicilina > 64 μg/ml). El test de difusión no diferencia aquellos aislamientos con resistencia normal de aquellos con alto nivel. El laboratorio debería determinar la CIM a penicilina o ampicilina para aquellos enterococos aislados de sangre y LCR, dado que E. faecium con bajo nivel de resistencia (penicilina < 64 μg/ml y ampicilina < 32 μg/ml) podrían ser potencialmente sensibles a la sinergia con un aminoglucósido (en el caso de ausencia de alto nivel de resistencia a aminoglucósidos), mientras que cepas con alto nivel de resistencia podrían ser resistentes a tal sinergia.
14.5.2 Resistencia a Vancomicina
Para la detección de enterococos resistentes a vancomicina mediante el método de difusión por discos se requiere que las placas sean incubadas por 24 hs. (en vez de 16 a 18 hs.), y que las zonas aparentes de inhibición con el disco de vancomicina sean cuidadosamente examinadas con luz transmitida para evidenciar pequeñas colonias o un tenue film de crecimiento dentro de la zona de inhibición. Si un enterococo de una infección severa es categorizado con resistencia intermedia a vancomicina según el método de difusión por discos, este resultado debe verificarse determinando la CIM a vancomicina según el documento M7 CLSI
14.5.3 Alto nivel de resistencia a aminoglucósidos
El alto nivel de resistencia a aminoglucósidos en enterococos predice que no se observará sinergia bactericida de penicilina o glicopéptidos con aminoglucósidos, como screening de este tipo de resistencia pueden usarse discos de alta carga de gentamicina (120 μg) y estreptomicina (300 μg). La ausencia de zonas de inhibición indican resistencia, y diámetros >10 mm son indicativos de ausencia de alto nivel de resistencia. Las cepas que presenten zonas de inhibición entre 7 y 9 mm deben verificarse usando el método de dilución según el documento M7. En la Tabla 3 se muestra como controlar los discos con altas cargas.
No es necesario probar otros aminoglucósidos porque sus actividades contra enterococo no son superiores a la gentamicina o la estreptomicina.
14.5.4 Detección de ß-lactamasas de espectro extendido en bacilos Gram Negativos
Las B-lactamasas de espectro extendido (ESBLs) son enzimas recientemente descriptas que provienen de mutaciones en genes que codifican B-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2 y SHV-1. Las ESBLs pueden conferir resistencia a cefotaxima, ceftacidima, aztreonam, penicilinas de espectro extendido y ß-lactámicos estructuralmente relacionados en aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, E. coli, y algunos otros géneros de la flia. Enterobacteriaceae que usualmente son sensibles a B-lactámicos de espectro extendido. Algunas ESBLs confieren resistencia a estos B-lactámicos y pueden ser facilmente detectadas por el test de difusión con discos (dan resistente o intermedio).
Otras, sin embargo, pueden mostrar bajo nivel de resistencia o solo podrían detectarse usando algún B-lactámico en particular. Estos últimos aislamientos podrían no alcanzar el valor de corte de resistencia según CLSI, a pesar de ser clínicamente resistentes a la terapia B-lactámica.
En aislamientos clínicos de Klebsiella spp. y E. coli con zonas de inhibición disminuidas a cefpodoxima, ceftacidima, aztreonam, cefotaxima, o ceftriaxona podría sospecharse la presencia de ESBLs. A estas cepas se les podría realizar el screening para detectar potenciales ESBL, usando el método descripto en la Tabla 2A.
En todas las cepas con ESBLs, los diámetros de las zonas inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam deberían aumentar en presencia de ac. Clavulánico (ver ESBL al final de la Tabla 2ª).
Todas las cepas productoras de ESBL, deberían ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam. Tabla 1 y 2A.
15 DETERMINACION DE ß-LACTAMASAS
15.1 Propósito
Una rápida determinación de ß-lactamasas brinda información clínica relevante mas tempranamente que el test de difusión por discos con Haemophilus spp., N. gonorrhoeae y Moraxella catarrhalis. Esta prueba es la única confiable para la detección de Enterococcus spp productores de ß-lactamasas.
Una determinación positiva de ß-lactamasas predice lo siguiente:
· Resistencia a penicilina, ampicilina y amoxicilina para Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, M catarrhalis; y resistencia a penicilina, acilamino, carboxy y ureidopenicilinas para Staphylococcus spp. y Enterococcus spp.
· Una determinación negativa de ß-lactamasa no descarta resistencia debido a otros mecanismos.
· No corresponde realizar la determinación de ß-lactamasas en Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. y otros bacilos gram negativos aeróbicos, dado que estos resultados no pueden predecir la susceptibilidad a los diferentes ß-lactámicos.
16 MICROORGANISMOS PROBLEMA
16.1 Detección de Resistencias en Staphylococcus spp.
161.1 Resistencia a meticilina u oxacilina
La resistencia a las penicilinas antiestafilococcicas resistentes a las ß-lactamasas se ha denominado históricamente meticilino resistencia. Es por eso que las siglas “MRSA” (methicillin-resistant S. aureus) o “MRS” (Methicillin-resistant staphylococci) se siguen utilizando aunque la meticilina ya no sea la droga de elección para la determinación de la sensibilidad o para el tratamiento.
En la actualidad algunos laboratorios continúan teniendo inconvenientes para la detección de MRS. Para mejorar la detección de estas cepas, se deben considerar los siguientes puntos:
a. Para detectar la meticilino resistencia se debe utilizar oxacilina, que es más adecuada que la meticilina o la nafcilina para este fin.
b. Para probar la sensibilidad a las penicilinas resistentes a penicilinasas (Ejm .oxacilina), tanto en las pruebas de dilución en agar como en caldo (ver Tabla 2C), se recomienda agregar al medio de cultivo ClNa 2% p/v.
c. El inóculo debe prepararse usando el método directo a partir de una placa de 24 horas y no el de crecimiento.
d. Las pruebas para la detección de meticilino resistencia se deben incubar a una temperatura de 33-35ºC (no superior a 35ºC) por un total de 24 hs (más que de 16-20 hs).
e. Se debe tener en cuenta que los estafilococos meticilino resistente son frecuentemente resistentes a otros antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia debe alertarnos sobre la posibilidad de meticilino resistencia.
f. Cuando el resultado de la CIM es dudoso con respecto a la posible meticilino-resistencia de un Staphylococcus spp. se recomienda realizar una prueba confirmatoria adicional como el “Screening” en placa suplementada con ClNa 2% p/v.
g. Tanto S. aureus como Staphylococcus coagulasa negativa meticilino resistentes, deben informarse resistentes a todos lo cefemes y otros ß-lactámicos tales como ampicilina / sulbactam, amoxicilina / clavulánico, ticarcilina / clavulánico, piperacilina / tazobactam e imipenem, independientemente del resultado de sensibilidad "in vitro".
h. Esto se debe a que hay muchos casos documentados de pobre respuesta al tratamiento de Staphylococcus meticilino resistentes (MRSA) con estas drogas y además no hay datos clínicos sobre la eficacia del tratamiento de los MRSA con ß-lactámicos.
17 DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXPANDIDO DE BACILOS GRAM NEGATIVO
Las ß-lactamasas de espectro expandido (BLEE o ESBLs) son enzimas cuyo origen proviene de mutaciones en genes que codifican ß-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2, y SHV-1. BLEEs puede conferir resistencia a cefotaxime, ceftazidine, aztreonam, penicilinas de espectro expandido, y ßlactamicos estructuralmente relacionadas a cepas aisladas en clínica de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, y unos pocos otros géneros de la familia Enterobacteriaceae que usualmente son susceptibles para ß-lactámicos de espectro extendido.
Algunos de estos aislamientos presentarán zonas de inhibición menores que la población normal sensible pero por encima del punto de corte de resistencia estándar para cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam..
En estos aislamientos se debe buscar la posible presencia de una ESBLs utilizando los puntos de corte listados en la tabla CLSI correspondiente.
En todos los aislamientos con BLEE los diámetros de las zonas de inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam se debe incrementar en presencia de ácido clavulánico. Todas las cepas productoras de BLEE deben ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam.
Screening y prueba confirmatoria de BLEE en K.pneumoniae, K.Oxytoca y E. coli en método de disco difusión
Método disco difusión
Screening Inicial
Test Fenotipico confirmatorio
Medio
Agar Mueller Hinton
Agar Mueller Hinton
Concentración de antimicrobianos en disco
Cefpodoximo 10 ug
Ceftazidina 30 ug
Aztreonam 30 ug
Cefotaxima 30 ug
Ceftriazona 30 ug
El uso de mas de un antimicrobiano, mejora la sensibilidad
Ceftazidina 30 ug
Ceftazidina / Acido clavulanico 30/10 ug
Y
Cefotaxima 30 ug
Cefotaxima / Acido clavulanico 30/10 ug
Los test confirmatorios requieren el uso de ambos cefotaximas y ceftazidima, solos y en combinación con acido clavulanico
Inoculo
Recomendaciones estándar de los sensidiscos
Condiciones de incubación
Duración de incubación
Resultados
Cefpodoximo ≤ 17 mm
Ceftazidina ≤ 22 mm
Aztreonam ≤ 27 mm
Cefotaxima ≤ 27 mm
Ceftriazona ≤ 25 mm
A ≥ 5 mm en el diámetro del halo para cualquiera de los agentes probados en combinación con ácido clavulanico versus su halo cuando es probado solo es igual a ESBL
Control de Calidad
E .coli ATCC 25922:
Cefpodoximo ≤ 23 – 28 mm
Ceftazidima ≤ 25-32 mm
Aztreonam ≤ 28-36 mm
Ceftriazona ≤ 29-35 mm
Cefotaxima ≤ 29-35 mm
E .coli ATCC 25922:
≤ 2 mm de diámetro en el halo del antimicrobiano probado solo versus la combinación con ácido clavulanico
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
Cefpodoximo ≤ 9 – 16 mm
Ceftazidima ≤ 10-18 mm
Aztreonam ≤ 9-17 mm
Cefotaxima ≤ 17 -25 mm
Ceftriazona ≤ 16-24 mm
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
5 mm de aumento en el halo de ceftazidima con acido clavulanico.
≥ 3 mm de aumento en el diámetro del acido clavulanico con cefotaxima.
ANEXOS
Tabla 1A. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias no fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.
(Tabla 1, NCCLS Vol.22, Nº1 Enero 2002)
Enterobacteriaceae
Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
GRUPO A
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina
Ceftazidima
Oxacilina
Penicilina o
ampicilina
Ceftazolina
Cefalotina
Gentamicina
Penicilina
Gentamicina
Mezlocilina o
Ticarcilina
Piperacillin
GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO
Amikacina
Amikacina
Azithromicina o clarithromicina o
Eritromicina
Linezolid
Amoxicilina /ácido clavulánico o ampicilina /sulbactam
Piperacilina / tazobactam
Ticarcilina / ácido clavulánico
Aztreonam
Cefoperazona
Quniupristin-Dalfopristin
Linezolid
Vancomicina
Cefamandole o Cefonicid o Cefuroxime
Clindamicina
Cefepime
Cefepime
Trimetoprim/ sulfametathoxazole
Cefmetazole
Cefoperazone
Cefotetan
Cefoxitin
Ciprofloxacina
Vancomicina
Cefotaxima
Ceftizoxima
Ceftriaxona
Imipenem o
Meropenem
Ciprofloxacina o
Levofloxacina
Tobramicnina
Imipenen o Meropenen
Mezlocilina o
Piperacilina / Ticarcilina
Trimetropin / Sulfametoxasol
GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO
Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa y acinetobacter spp
Staphylococcus spp
Enterococcus spp
Aztreonam
Ceftazidima ( ambos indicadores útiles de β-Lactámicos de espectro extendido)
Cefotaxima o Ceftriazona
Cloranfenicol
Gentamicina ( solo para detección de resistencia de alto nivel)
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Metilmicina
Estreptomicina (solo para deteccion de resistencia de alto nivel)
Kanamicina
Trimetropin / Sulfametoxazol
Ciprofloxacina o Levofloxacina o Ofloxacina o Gentifloxacina
Metilmicina
Gentamicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Tetraciclina
Rifampicina
(pueden ser probados para Enterococcus resistentes a vancomicina)
Tetraciclina
Rifampicina
Tobramicina
Tetraciclina
GRUPO U
SUPLEMENTARIO
SOLO TRACTO URINARIO
Carbenicilina
Carbenicilina
Lomefloxacina o
Norfloxacina
Ciprofloxacina
Levofloxacina
Norfloxacina
Cinoxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Ofloxacina
Ceftizoxima
Nitrofurantoina
Nitrofurantoina
Gatifloxacina
Loracarbef
Nitrofurantoina
Levofloxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Orfloxacina
Sulfisoxasole
Tetraciclina
Sulfisoxasole
Sulfisoxasole
Trimetropin
Trimetropin
Tetraciclina
Tabla 2. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.
Haemophilus spp.
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
distinto que
Streptococcus
pneumoniae
GRUPOA
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina
Eritromicina
Eritromicina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
Penicilina (disco de oxacilina)
Penicilina o ampicilina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO
Cefotaxima o ceftazidima o ceftizoxima o ceftriaxona
Clindamicina
Gatifloxacino o levofloxacina
Moxifloxacino o sparfloxacina
Ofloxacina
Cloranfenicol
Cefuroxima sódica (parenteral)
Tetraciclina
Clindamicina
Meropenem
Cloranfenicol
Meropenem
Vancomicina
Vancomicina
GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO
Azitromicina o claritromicina
Cefixima o cefotaxima o cefpodoxima o ceftizoxima o ceftriaxona
Cloranfenicol
Aztreonam
Linezolid
Cefaclor o cefprozil o loracarbef
Cefdinir o Cefixima o Cefpodoxima
Cefmetazole
Cefotetan
Cefoxitin
Cefuroxima
Rifampicina
Levofloxacina
Ofloxacina
Cefonicid
Linezolid
Acetil cefuroxima (oral)
Ciprofloxacina o grepafloxacina o ofloxacina
Quinupristin-Dalfopristin
Ciprofloxacina
Gatifloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Moxifloxacino
Ofloxacina
Esparfloxacina
Penicilina
Imipenen
Espectinomicina
Rifampicina
Tetraciclina
Tetraciclina
El presente manual de procedimiento en microbiología tiene como objetivo ser un instrumento que determine las pautas que normalicen el procedimiento en la identificación y susceptibilidad de las cepas que ocasionan diversas patologías en la comunidad
2. Alcance:
La aplicación del presente manual se circunscribe para el Servicio de Microbiología del Laboratorio de Referencia Regional de la DIRESA LIMA.
3. Generalidades:
El control de calidad de un laboratorio implica un conjunto de medidas que garanticen la obtención de resultados confiables además de que abarquen los elementos que posibiliten la optimización del trabajo.
En este sentido el control de calidad tienen una influencia relevante en la identificación de las diversas cepas patógenas que afectan a la comunidad.
4. Responsabilidades:
El encargado del área es el responsable del cumplimiento y la puesta en practica del manual de procedimientos en microbiología.
5. Introducción
La técnica actualmente utilizada para la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales desde hace más de dos décadas enfocados a normatizar el método.
El comité de expertos de la OMS. y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los países europeos.
Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretación de estas pruebas continúa siendo un tema de importantes esfuerzos internacionales.
Europa está dividida en varias regiones de influencia con diferentes sistemas de sensibilidad antimicrobiana:
El Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los países bajos, la Sociedad Británica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiología y el Comité Americano de Estandarización de Laboratorios Clínicos (CLSI).
En nuestro país y en la mayoría de los países latinoamericanos se siguen las pautas del CLSI con algunas modificaciones.
El siguiente es un resumen de la metodología referida habitualmente como "Método de la OMS.", que no difiere substancialmente del conocido "Kirby- Bauer". Las tablas de interpretación fueron tomadas de las normas M2 – A7 del National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI)
El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión.
Se formará así por difusión, un gradiente de concentración del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del reservorio.
El diámetro obtenido dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa del agar, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de duplicación bacteriana, y el tamaño y fase de crecimiento del inóculo.
Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados cuidadosamente.
El método recomendado por la CLSI (Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing) se basa en los estudios de Bauer y colaboradores, este es el método descrito de manera más completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio.
El único método alternativo que ha sido estudiado adecuadamente y que demostró datos comparables de los diámetros de las zonas de inhibición, con precisión similar y correlación satisfactoria con la CIM, es la modificación de doble capa de Barry, García y Thrupp. Este método es una alternativa aceptable para la normalización del inóculo en las pruebas de sensibilidad de aislamientos de gérmenes patógenos de rápido crecimiento, como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa.
El método de doble capa en agar no es aplicable a las pruebas con otros microorganismos tales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc.
Las pruebas por cualquiera de los dos métodos pueden interpretarse con las mismas tablas de medida de los halos de inhibición si los resultados de las pruebas con las cepas controles se encuentran dentro de los rangos esperados.
6. Selección de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad
La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para el test de difusión, es una decisión de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1 y 1A enumeran los agentes de eficacia clínica probada para el tratamiento de infecciones por microorganismos que muestran una respuesta aceptable con las pruebas in Vitro.
Las consideraciones que se han considerado en la designación de un agente antimicrobiano a un grupo específico incluyen: eficacia clínica, prevalencia de resistencia, costo, recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos.
7. Descriptores:
Los antibióticos deberán ser referidos por su nombre genérico.
7.1 ß-Lactámicos
Los antibióticos ß-lactámicos poseen un anillo central de cuatro átomos denominado anillo ß-lactámico. Su principal modo de acción es la inhibición de la síntesis de pared celular.
El agregado de grupos sustituyentes al anillo ß-Lactámico u otras estructuras cíclicas adicionales determinan si el agente es una penicilina, una cefalosporina, un carbapenem o un monobactam.
7.2 Penicilinas
El espectro de las penicilinas está dirigido a bacterias no productoras de ß- Lactamasas Gram positivas, algunos fastidiosos y Gram negativos.
Las acilamino-penicilinas (ampicilina y amoxicilina) poseen actividad contra muchas especies Gram. Negativas, incluyendo miembros de la familia Enterobacteriaceae no productoras de ß-lactamasas, las carboxipenicilinas
(carbenicilina y ticarcilina) y las ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina)
Poseen un amplio espectro contra Gram negativos incluyendo algunas especies de Pseudomonas. Las penicilinas resistentes a las penicilinasas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) poseen actividad contra gram positivos, inclusive los Staphylococcus productores de penicilinasas.
7.3 Combinación de ß-Lactámico / inhibidor de ß-Lactamasas
Esta combinación antimicrobiana incluye a una penicilina y un segundo agente que posee una actividad antibacteriana mínima pero funciona como inhibidor de algunas ß-lactamasas.
7.4 Cefalosporinas y otros Cephems
Las distintas cefalosporinas y cephems frecuentemente poseen un espectro de
actividad levemente diferente contra bacterias gram positivas y gram negativas.
Estos agentes son frecuentemente referidos como cefalosporinas de "primera", "segunda" o "tercera" generación, dependiendo en gran parte de su actividad frente a bacterias gram negativas con alto grado de resistencia.
Debido a las diferencias de actividad de algunos miembros de este grupo, deberían selecccionarse representantes de cada grupo para los test de rutina.
7.5 Carbapenemes
La estructura de los carbapenemes difiere levemente de la estructura de la penicilinas y son mucho más resistentes a la hidrólisis por las ß-lactamasas. Esta característica les provee un amplio espectro de actividad contra muchas bacterias gram negativas y gram positivas.
7.6 Monobactames
Los monobactames son estructuralmente los únicos antibióticos que muestran actividad sólo contra bacterias gram negativas aeróbicas. Hasta el momento, el aztreonam es el único monobactam aprobado para su uso por el USFDA.
7.7 Glicopéptidos
Los glicopéptidos poseen una compleja estructura química y actúan inhibiendo la síntesis de pared celular en un sitio diferente al de los ß-Lactámicos. La actividad de este grupo está dirigida a las bacterias gram positivas.
La vancomicina es aceptada para el tratamiento de infecciones por bacterias gram positivas en pacientes alérgicos a la penicilina y también es útil para la terapia de infecciones debidas a especies bacterianas resistentes a ß- Lactámicos, Ejm: Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) y algunos enterococos.
7.8 Aminoglucósidos
Son un grupo de antibióticos de estructura similar que inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal. el espectro de actividad de los miembros de este grupo, está determinado por la existencia de enzimas bacterianas inactivantes de aminoglucósidos.
Pueden utilizarse para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gram negativos aeróbicos o en combinaciones sinérgicas (con antibióticos inhibidores de la síntesis de pared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, Ejm Enterococos.
7.9 Macrólidos
Los macrólidos son antibióticos estructuralmente relacionados que inhiben la síntesis proteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercado que podrían ser considerados para ensayar en bacterias gram positivas o en algunos gram negativos fastidiosos.
7.10 Tetraciclinas
Las tetraciclinas inhiben la síntesis de proteínas a nivel ribosomal, de ciertas bacterias gram positivas y negativas. Las drogas de este grupo están relacionadas y salvo escasas excepciones, sólo la tetraciclina debería ser ensayada de rutina.
7.11 Quinolonas
Este grupo de compuestos incluye un número de agentes antimicrobianos íntimamente relacionados que funcionan primariamente inhibiendo la actividad de la DNA-girasa de muchas bacterias gram positivas y negativas. Diferencias sutiles en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensayen como agentes individuales.
7.12 Sulfonamidas y Trimetoprima
Este grupo de compuestos, abarcan varios agentes quimioterapéuticos con similar espectro de actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato.
El sulfisoxazol es la sulfonamida más comúnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lo tanto podría ser apropiada su selección para un test in-vitro. El sulfametoxazol es usualmente ensayado en combinación con trimetoprima, estos producen una inhibición secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias gram positivas y negativas.
Cepas con dificultades de crecimiento
Solo bacterias aeróbicas o facultativas que crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton sin suplementar podrían ser procesadas en este medio.
Para las pruebas con cepas que no crecen satisfactoriamente en agar Mueller Hinton no suplementado (Ejm. S. pneumoniae, estreptococos Bhemolíticos y viridans) se adiciona sangre de oveja desfibrinada al medio fundido y enfriado, n una concentración final de 5 % (V/V).
Cuando la sangre se agrega al agar Mueller Hinton, los límites del control de oxacilina y meticilina serán levemente menores (2-3 mm.) a aquellos obtenidos con agar Mueller Hinton no suplementado. Esto podría resultar en zonas de inhibición menores a los límites aceptables con Staphylococcus aureus ATCC® 25923 definidos en la Tablas 3.
El agregado de sangre de carnero puede causar una fina película de crecimiento del microorganismo dentro de la zona de inhibición alrededor de los discos de sulfonamidas y trimetoprima. El agar chocolate no debe usarse para las pruebas con Haemophilus spp. El medio apropiado para este microorganismo es el agar HTM
Almacenamiento de los discos de ATB
Los discos de ATB deberán ser almacenados de la siguiente manera:
· Mantenerlos refrigerados a 8 ºC o en freezer a -14 ºC o menos, para mantener la droga en condiciones óptimas.
· Los discos que contienen drogas de la familia de antibióticos betalactámicos deben mantenerse en freezer para mantener su potencia. Los de pequeños stocks puedenmantenerse en el refrigerador.
· Los discos deben ser sacados del refrigerador o freezer 1 ó 2 horas antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la temperatura antes de ser abiertos los frascos. Este proceso evita la condensación que podría ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los frascos fríos.
· Cuando el indicador del desecador usado cambia de color debe interpretarse como un exceso de humedad y reemplazarse.
· Use solo los discos que no han sido calificados por sus fabricantes como vencidos.
Pautas para la selección del antimicrobiano
Para que una prueba de susceptibilidad sea práctica y relevante, el número de agentes antimicrobianos debería ser limitado.
En la tabla 1 y 2 se indica las drogas que deberían usarse de rutina en muchos laboratorios clínicos. La tabla esta dividida en columnas basadas en organismos específicos o grupos de organismos, y la variedad de drogas están indicadas por prioridad para realizar la prueba con el fin de ayudar al laboratorio en la selección de la prueba de rutina.
Se designan grupos de agentes comparables que generalmente no requieren ser duplicados en una prueba ya que la interpretación de los resultados es usualmente similar, y la eficacia clínica usualmente comparable.
La palabra "o" designa a grupos de agentes relacionados, los cuales muestran un espectro casi idéntico de actividad e interpretación de resultados, por esto, usualmente sólo uno de estos agentes necesita ser seleccionado para la prueba.
Pauta sugerida para Pruebas de Rutina, Selectivas e Informes
Grupo A
Los agentes de este grupo se consideran apropiados para incluirlos en la rutina, como panel primario de prueba por lo que el informe de rutina debe incluirlos todos.
Grupo B
Comprende agentes que son importantes clínicamente, particularmente para infecciones nosocomiales, ellos deben ser informados sólo selectivamente, cuando el organismo es resistente a agentes de la misma clase, en el Grupo A.
Grupo C
Comprende agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios que pueden requerir pruebas en aquellas instituciones que mostraron endemias o epidemias de cultivos resistentes a muchas drogas primarias (especialmente en la misma clase, por ejemplo ß-lactámicos o aminoglicósidos); para tratamiento de pacientes alérgicos a drogas primarias; para tratamiento de organismos inusuales (por ejemplo cloranfenicol para aislados extraintestinal de Salmonella spp algún Enterococcus resistente a vancomicina).
Grupo U
Nombra ciertos agentes antimicrobianos (por ejemplo Nitrofurantoina y algunas quinolonas), que están limitadas a tratamiento de infecciones del tracto urinario.
Estos agentes no son para ser probados contra patógenos recuperados de otro sitio de infección que no sea el tracto urinario.
Grupo O
Incluye agentes que tienen indicación clínica para el grupo de organismo pero no están indicados en los test de rutina.
Grupo Inv.
Incluye agentes que se están investigando y aún no han sido aprobados por la FDA.
Turbidez estándar para la preparación del inóculo
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de bario como estándar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland).
Para prepararlo proceda de la siguiente manera:
a. Prepare dicho estándar agregando 0,5 ml de BaCl2 0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V).
b.Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro. La absorbancia a 625 nm debería ser 0,08 - 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.
c. Distribuya 4 - 6 ml dentro de tubos similares a los que va a usar para preparar inóculos.
d.Mantenga los estándares guardados a temperatura ambiente al abrigo de la luz.
e. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso para lograr una turbidez homogénea.
f. Reemplace o verifique la confiabilidad de los estándares mensualmente.
Procedimiento para la realización del test de difusion por disco
13.1 Preparación del inóculo
13.1.1 Método de desarrollo previo
1. Seleccione 1 ó 2 colonias bien aisladas de igual morfología de la placa de cultivo.
2. Prepare una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo apropiado (Ejm: tripticasa de soya o agua destilada estéril) tocando la parte superior de cada colonia.
3. Ajuste la turbidez del inóculo con solución salina o caldo hasta el tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland, por comparación visual con el estandar. Para ello, mire los tubos contra un fondo blanco con una línea negra como contraste. Esta suspensión contendrá aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml
4. no debe de pasar más de 15 minutos desde la suspensión de la cepa problema hasta su sembrado en la placa de Mueller Hinton.
13.1.2 Inoculación de las placas
1. Dentro de los 15 minutos después de ajustado el inóculo siembre las placas de M. Hinton con un hisopo estéril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin de escurrir el exceso de inóculo.
2. Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones para asegurar una completa distribución del inóculo. Las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y el desarrollo confluente o casi confluente.
3. Si crecen solo colonias aisladas el antibiograma debe repetirse.
4. Espere de 3 a 5 minutos, pero no más de 15 min. antes de aplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.
13.1.3 Aplicación de los discos de ATB en las placas inoculadas
1. Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estéril aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.
2. Debido a que algunas drogas difunden casi instantáneamente, un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar.
3. No deben colocarse más de 12 discos por placa de 150 mm y no más de 5 discos por placa de 100 mm.
4. Incubar las placas invertidas a 35ºC dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueron aplicados. Con excepción de Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus spp, las placas no deberán ser incubadas en concentración incrementada de CO2 porque los estándares de interpretación fueron desarrollados usando incubación ambiente y el agregado de CO2 alteraría significativamente el tamaño de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibióticos.
13.1.4 Lectura de las placas e interpretación de resultados
1. Después de 16 a 18 horas de incubación examine cada placa y mida los diámetros de las zonas de inhibición. Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición serán uniformemente circulares y habrá desarrollo confluente.
2. Si el microorganismo estudiado es un Staphylococcus spp. o Enterococcus spp., incube 24 horas para vancomicina y oxacilina, pero los otros antimicrobianos pueden leerse entre las 16-18 horas.
3. Use luz transmitida para examinar un ligero crecimiento de cepas meticilino o vancomicina resistentes dentro de las zonas de inhibición.
4. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de meticilino o vancomicina resistencia.
5. Los tamaños de las zonas de inhibición serán interpretados con las Tabla 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H o 2I y los organismos se informarán sensibles, intermedios o resistentes frente al antimicrobiano ensayado.
14 MICROORGANISMOS FASTIDIOSOS
14.1Haemophilus spp.
14.1.1 Medio
El medio de elección para la prueba de difusión por discos para Haemophilus spp es el Haemophilus Test Médium (HTM).
14.1.2 Procedimiento
· Realice una suspensión en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate incubada durante 20 - 24 horas. Ajuste a una turbidez equivalente al estándar 0,5 Mc Farland (1-4 X 108 UFC/ml). Debe tenerse cuidado de no preparar inóculos densos que puedan llevar a resultados falsos resistentes con cefalosporinas, especialmente cuando se trabaja con Haemophilus influenzae productores de Betalactamasa. hisope la placa de HTM dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
· No deberán aplicarse más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
· Las placas serán incubadas por 16-18 horas. en una atmósfera con 5% CO2 a 35ºC.
· En la lectura se debe considerar la zona de inhibición que no presente desarrollo obvio visible, un desarrollo débil o pequeñas colonias que podrían aparecer cercanas a la zona mas obvia de inhibición deberán ser ignoradas en la medición.
14.1.3 Interpretación
El criterio para la interpretación de la medida de los diámetros de halo están enumerados en la Tabla 2E. Los antibióticos que deben probarse para Haemophilus spp están enumerados en la Tabla 1A.
No se recomienda la prueba por difusión para Haemophilus spp con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A
14.2Neisseria gonorrhoeae
14.2.1 Medio
El medio recomendado para probar la sensibilidad de N. gonorrhoeae, es agar GC, autoclavado, con un 1 % de un suplemento de composición definida.
El agar chocolate enriquecido no es recomendado para determinar la sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae.
14.2.2 Procedimiento
1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar chocolate y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 Mc Farland.
2. Hisope la placa dentro de los 15 min. de haber ajustado el inóculo.
3. No se deberán aplicar más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm cuando se prueben agentes que produzcan grandes zonas de inhibición (Ejm. quinolonas).
4. Las placas serán incubadas 20 - 24 horas a 35 ºC en atmósfera de CO2 (5 %).
14.2.3 Interpretación
Los antibióticos que deben probarse para N. gonorrhoeae están enumerados en la Tabla 1A. No se recomienda la prueba por difusión para N. gonorrhoeae con otros discos que no sean los enumerados en la Tabla 1A. La Tabla 2F nos brinda los detalles de criterios de interpretación. Los organismos con diámetros de halo <19 mm con discos de Penicilina de 10 UI generalmente son cepas productoras de ß-lactamasa.
Sin embargo, para el reconocimiento de esta resistencia plasmídica se prefiere la prueba de betalactamasa los microorganismos con resistencia plasmídica a la tetraciclina también muestran un diámetro < 19 mm (30 μg tetraciclina).
Por otra parte existen cepas resistentes a tetraciclina y penicilina por mecanismos cromosómicos que muestran diámetros de inhibición mayores; los cuales pueden ser adecuadamente reconocidas usando los criterios de interpretación indicados en la Tabla 2F.
14.3Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp.
14.3.1 Medio
El medio recomendado para Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp. es agar Mueller Hinton suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero. No son recomendados los medios preparados usando otras bases u otras clases de sangre.
14.3.2 Procedimiento
1. Resuspenda el microorganismo en caldo Mueller Hinton o agua destilada a partir de una placa de agar sangre de carnero over night (16-18 hs.) y ajuste a turbidez equivalente al 0,5 de Mc Farland. Hisope la placa dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo.
2. No se deberán de aplicars más de 9 discos en las placas de 150 mm y no más de 4 discos en las placas de 100 mm.
3. Las placas serán incubadas a 35 ºC en atmósfera con 5 % de CO2. por 20 - 24 hs.
14.3.3 Interpretación
Los aislamientos de S. pneumoniae con zonas de inhibición para oxacilina >20 mm son considerados sensibles (CIMs < 0.06 μg) a penicilina. Zonas de inhibición < 19 mm pueden obtenerse con cepas resistentes, intermedias y ciertas cepas sensibles a penicilina.
Por lo tanto, todos aquellos aislamientos que presenten zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina (1 μg) se les debería determinar las CIMs a penicilina, meropenem y cefotaxima o ceftriaxona. S. pneumoniae no debe informarse como resistente o intermedio a penicilina en base solamente a zonas de inhibición < 19 mm con el disco de oxacilina.
No se recomienda usar el disco de OXA (1μg) para determinar la susceptibilidad a penicilina en otros estreptococos distintos a S. pneumoniae.
El disco de penicilina o ampicilina puede ser usado para predecir la sensibilidad a estreptococos ß-hemolíticos, no así para estreptococos del grupo viridans. En aislamientos de S. viridans obtenidos de sitios normalmente estériles (Ejm. hueso, LCR, sangre, etc.), debería determinarse la CIM a penicilina. El test de difusión con penicilina (u OXA) no es apropiado para estreptococos del grupo viridans.
Los aislamientos de S. pneumoniae que dan >20mm con oxacilina son sensibles a penicilina y pueden ser considerados sensibles a ampicilina, amoxicilina, amoxicilina / ac. Clavulánico, ampicilina/ sulbactam, cefaclor, cefepime, cefetamet, cefixima, imipenem, y loracarbef por lo que esas drogas no requieren ser probadas.
No existen aún criterios apropiados de interpretación para el ensayo por difusión de la sensibilidad de algunos antimicrobianos útiles para el tratamiento de S. pneumoniae como amoxicilina, ampicilina, cefuroxima, cefepime, cefotaxima, ceftriazona, imipenem y meropenem. En estos casos se debe de realizar el CIM.
Puntos de corte para Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
CIM ug/ml
S
I
R
Amoxicilina
No meningitis
≤ 2
4
≥ 8
Amoxicilina /Acido clavulanico
No meningitis
≤ 2/1
4/2
≥ 8/4
Los puntos de corte para cefotaxima, ceftriazona y cefepime se han reevaluado de acuerdo a la procedencia del microorganismo en “meningitis” o “no meningitis”
CIM
Ug/ml
Cefotaxima
Ceftriazona
Cefepime
S
I
R
S
I
R
S
I
R
Meningitis
≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
≤ 0.5
1
≥ 2
No meningitis
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4
≤ 1
2
≥ 4
14.4Detección de Estafilococos Resistentes
14.4.1 Meticilino/Oxacilino Resistencia
Históricamente se ha referido a “meticilino resistencia” como MRSA (para S. aureus meticilino resistente) o MRS (para estafilococo meticilino resistente) aún cuando la meticilina no ha sido desde hace tiempo el agente de elección ni para los test de sensibilidad ni para tratamiento. varios términos para referirnos a la resistencia a estos agentes: “MRS”, “meticilino resistencia” u “oxacilino resistencia”. Los problemas asociados con la detección de MRS continúan siendo estudiados por algunos laboratorios.
Para el mejor reconocimiento de estas cepas, deberán considerase los siguientes puntos:
· El disco de oxacilina en la prueba por difusión es más apropiado para detectar resistencia que el disco de meticilina o nafcilina. Por lo tanto se recomienda el uso del disco de oxacilina (1 μg) para la detección de meticilina/oxacilina resistencia.
· El inóculo se debe preparar a partir de una placa de 18 a 24 horas de incubación como se describe en la sección 5.1.2., sin preincubación.
· Los test para detectar MRS deben ser incubados por 24 hs. completas (no 16-18 hs.) a 35 ºC.
· Debe inspeccionarse cuidadosamente la zona alrededor del disco de OXA usando luz transmitida para poder así visualizar pequeñas colonias o la presencia de un fino desarrollo dentro de la zona de inhibición.
· La mayoría de los MRS son usualmente resistentes a múltiples antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia podría ser indicio de meticilino resistencia.
· Si el método de difusión por discos resultara dudoso con un posible Staphylococcus spp. meticilino resistente, deberán realizarse pruebas confirmatorias adicionales, tales como el test de screening en agar salado, según el documento M7 CLSI.
· Los S. aureus meticilino resistentes (MRSA) y S. coagulasa negativa meticilino resistentes deben informarse como resistentes a todos los cephems y los otros ßlactámicos, tales como amoxicilina/clavulánico, ampicilina/sulbactam, ticarcilina/clavulánico, piperacilina/tazobactam e imipenem, independientemente de los resultados in-vitro con estos agentes. Esto es debido a que la mayoría de los casos documentados de infecciones por MRSA han respondido pobremente a la terapia con ß-lactámicos o porque aún no se han presentado datos clínicos convincentes que documenten la eficacia clínica de estos agentes.
14.5Resistencia en Enterococcus spp.
14.5.1 Resistencia a Penicilina / Ampicilina
Los enterococos pueden ser resistentes a penicilina y ampicilina debido a la producción de proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) de baja afinidad o a la producción de ß-lactamasas.
El test de difusión por discos puede detectar adecuadamente aislamientos con PBPs alteradas, pero presenta resultados dudosos con cepas productoras de ß- lactamasas estas últimas pueden ser mejor detectadas mediante el uso de Nitrocefín
Ciertos enterococos penicilino o ampicilino resistentes pueden presentar alto nivel de resistencia (p.ej. CIM a penicilina > 128 μg/ml o ampicilina > 64 μg/ml). El test de difusión no diferencia aquellos aislamientos con resistencia normal de aquellos con alto nivel. El laboratorio debería determinar la CIM a penicilina o ampicilina para aquellos enterococos aislados de sangre y LCR, dado que E. faecium con bajo nivel de resistencia (penicilina < 64 μg/ml y ampicilina < 32 μg/ml) podrían ser potencialmente sensibles a la sinergia con un aminoglucósido (en el caso de ausencia de alto nivel de resistencia a aminoglucósidos), mientras que cepas con alto nivel de resistencia podrían ser resistentes a tal sinergia.
14.5.2 Resistencia a Vancomicina
Para la detección de enterococos resistentes a vancomicina mediante el método de difusión por discos se requiere que las placas sean incubadas por 24 hs. (en vez de 16 a 18 hs.), y que las zonas aparentes de inhibición con el disco de vancomicina sean cuidadosamente examinadas con luz transmitida para evidenciar pequeñas colonias o un tenue film de crecimiento dentro de la zona de inhibición. Si un enterococo de una infección severa es categorizado con resistencia intermedia a vancomicina según el método de difusión por discos, este resultado debe verificarse determinando la CIM a vancomicina según el documento M7 CLSI
14.5.3 Alto nivel de resistencia a aminoglucósidos
El alto nivel de resistencia a aminoglucósidos en enterococos predice que no se observará sinergia bactericida de penicilina o glicopéptidos con aminoglucósidos, como screening de este tipo de resistencia pueden usarse discos de alta carga de gentamicina (120 μg) y estreptomicina (300 μg). La ausencia de zonas de inhibición indican resistencia, y diámetros >10 mm son indicativos de ausencia de alto nivel de resistencia. Las cepas que presenten zonas de inhibición entre 7 y 9 mm deben verificarse usando el método de dilución según el documento M7. En la Tabla 3 se muestra como controlar los discos con altas cargas.
No es necesario probar otros aminoglucósidos porque sus actividades contra enterococo no son superiores a la gentamicina o la estreptomicina.
14.5.4 Detección de ß-lactamasas de espectro extendido en bacilos Gram Negativos
Las B-lactamasas de espectro extendido (ESBLs) son enzimas recientemente descriptas que provienen de mutaciones en genes que codifican B-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2 y SHV-1. Las ESBLs pueden conferir resistencia a cefotaxima, ceftacidima, aztreonam, penicilinas de espectro extendido y ß-lactámicos estructuralmente relacionados en aislamientos clínicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, E. coli, y algunos otros géneros de la flia. Enterobacteriaceae que usualmente son sensibles a B-lactámicos de espectro extendido. Algunas ESBLs confieren resistencia a estos B-lactámicos y pueden ser facilmente detectadas por el test de difusión con discos (dan resistente o intermedio).
Otras, sin embargo, pueden mostrar bajo nivel de resistencia o solo podrían detectarse usando algún B-lactámico en particular. Estos últimos aislamientos podrían no alcanzar el valor de corte de resistencia según CLSI, a pesar de ser clínicamente resistentes a la terapia B-lactámica.
En aislamientos clínicos de Klebsiella spp. y E. coli con zonas de inhibición disminuidas a cefpodoxima, ceftacidima, aztreonam, cefotaxima, o ceftriaxona podría sospecharse la presencia de ESBLs. A estas cepas se les podría realizar el screening para detectar potenciales ESBL, usando el método descripto en la Tabla 2A.
En todas las cepas con ESBLs, los diámetros de las zonas inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam deberían aumentar en presencia de ac. Clavulánico (ver ESBL al final de la Tabla 2ª).
Todas las cepas productoras de ESBL, deberían ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam. Tabla 1 y 2A.
15 DETERMINACION DE ß-LACTAMASAS
15.1 Propósito
Una rápida determinación de ß-lactamasas brinda información clínica relevante mas tempranamente que el test de difusión por discos con Haemophilus spp., N. gonorrhoeae y Moraxella catarrhalis. Esta prueba es la única confiable para la detección de Enterococcus spp productores de ß-lactamasas.
Una determinación positiva de ß-lactamasas predice lo siguiente:
· Resistencia a penicilina, ampicilina y amoxicilina para Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, M catarrhalis; y resistencia a penicilina, acilamino, carboxy y ureidopenicilinas para Staphylococcus spp. y Enterococcus spp.
· Una determinación negativa de ß-lactamasa no descarta resistencia debido a otros mecanismos.
· No corresponde realizar la determinación de ß-lactamasas en Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. y otros bacilos gram negativos aeróbicos, dado que estos resultados no pueden predecir la susceptibilidad a los diferentes ß-lactámicos.
16 MICROORGANISMOS PROBLEMA
16.1 Detección de Resistencias en Staphylococcus spp.
161.1 Resistencia a meticilina u oxacilina
La resistencia a las penicilinas antiestafilococcicas resistentes a las ß-lactamasas se ha denominado históricamente meticilino resistencia. Es por eso que las siglas “MRSA” (methicillin-resistant S. aureus) o “MRS” (Methicillin-resistant staphylococci) se siguen utilizando aunque la meticilina ya no sea la droga de elección para la determinación de la sensibilidad o para el tratamiento.
En la actualidad algunos laboratorios continúan teniendo inconvenientes para la detección de MRS. Para mejorar la detección de estas cepas, se deben considerar los siguientes puntos:
a. Para detectar la meticilino resistencia se debe utilizar oxacilina, que es más adecuada que la meticilina o la nafcilina para este fin.
b. Para probar la sensibilidad a las penicilinas resistentes a penicilinasas (Ejm .oxacilina), tanto en las pruebas de dilución en agar como en caldo (ver Tabla 2C), se recomienda agregar al medio de cultivo ClNa 2% p/v.
c. El inóculo debe prepararse usando el método directo a partir de una placa de 24 horas y no el de crecimiento.
d. Las pruebas para la detección de meticilino resistencia se deben incubar a una temperatura de 33-35ºC (no superior a 35ºC) por un total de 24 hs (más que de 16-20 hs).
e. Se debe tener en cuenta que los estafilococos meticilino resistente son frecuentemente resistentes a otros antibióticos, incluyendo otros ß-lactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, clindamicina y tetraciclina. La observación de múltiple resistencia debe alertarnos sobre la posibilidad de meticilino resistencia.
f. Cuando el resultado de la CIM es dudoso con respecto a la posible meticilino-resistencia de un Staphylococcus spp. se recomienda realizar una prueba confirmatoria adicional como el “Screening” en placa suplementada con ClNa 2% p/v.
g. Tanto S. aureus como Staphylococcus coagulasa negativa meticilino resistentes, deben informarse resistentes a todos lo cefemes y otros ß-lactámicos tales como ampicilina / sulbactam, amoxicilina / clavulánico, ticarcilina / clavulánico, piperacilina / tazobactam e imipenem, independientemente del resultado de sensibilidad "in vitro".
h. Esto se debe a que hay muchos casos documentados de pobre respuesta al tratamiento de Staphylococcus meticilino resistentes (MRSA) con estas drogas y además no hay datos clínicos sobre la eficacia del tratamiento de los MRSA con ß-lactámicos.
17 DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXPANDIDO DE BACILOS GRAM NEGATIVO
Las ß-lactamasas de espectro expandido (BLEE o ESBLs) son enzimas cuyo origen proviene de mutaciones en genes que codifican ß-lactamasas plasmídicas tales como TEM-1, TEM-2, y SHV-1. BLEEs puede conferir resistencia a cefotaxime, ceftazidine, aztreonam, penicilinas de espectro expandido, y ßlactamicos estructuralmente relacionadas a cepas aisladas en clínica de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, y unos pocos otros géneros de la familia Enterobacteriaceae que usualmente son susceptibles para ß-lactámicos de espectro extendido.
Algunos de estos aislamientos presentarán zonas de inhibición menores que la población normal sensible pero por encima del punto de corte de resistencia estándar para cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam..
En estos aislamientos se debe buscar la posible presencia de una ESBLs utilizando los puntos de corte listados en la tabla CLSI correspondiente.
En todos los aislamientos con BLEE los diámetros de las zonas de inhibición para una o más cefalosporinas de espectro extendido o aztreonam se debe incrementar en presencia de ácido clavulánico. Todas las cepas productoras de BLEE deben ser informadas como resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam.
Screening y prueba confirmatoria de BLEE en K.pneumoniae, K.Oxytoca y E. coli en método de disco difusión
Método disco difusión
Screening Inicial
Test Fenotipico confirmatorio
Medio
Agar Mueller Hinton
Agar Mueller Hinton
Concentración de antimicrobianos en disco
Cefpodoximo 10 ug
Ceftazidina 30 ug
Aztreonam 30 ug
Cefotaxima 30 ug
Ceftriazona 30 ug
El uso de mas de un antimicrobiano, mejora la sensibilidad
Ceftazidina 30 ug
Ceftazidina / Acido clavulanico 30/10 ug
Y
Cefotaxima 30 ug
Cefotaxima / Acido clavulanico 30/10 ug
Los test confirmatorios requieren el uso de ambos cefotaximas y ceftazidima, solos y en combinación con acido clavulanico
Inoculo
Recomendaciones estándar de los sensidiscos
Condiciones de incubación
Duración de incubación
Resultados
Cefpodoximo ≤ 17 mm
Ceftazidina ≤ 22 mm
Aztreonam ≤ 27 mm
Cefotaxima ≤ 27 mm
Ceftriazona ≤ 25 mm
A ≥ 5 mm en el diámetro del halo para cualquiera de los agentes probados en combinación con ácido clavulanico versus su halo cuando es probado solo es igual a ESBL
Control de Calidad
E .coli ATCC 25922:
Cefpodoximo ≤ 23 – 28 mm
Ceftazidima ≤ 25-32 mm
Aztreonam ≤ 28-36 mm
Ceftriazona ≤ 29-35 mm
Cefotaxima ≤ 29-35 mm
E .coli ATCC 25922:
≤ 2 mm de diámetro en el halo del antimicrobiano probado solo versus la combinación con ácido clavulanico
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
Cefpodoximo ≤ 9 – 16 mm
Ceftazidima ≤ 10-18 mm
Aztreonam ≤ 9-17 mm
Cefotaxima ≤ 17 -25 mm
Ceftriazona ≤ 16-24 mm
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
5 mm de aumento en el halo de ceftazidima con acido clavulanico.
≥ 3 mm de aumento en el diámetro del acido clavulanico con cefotaxima.
ANEXOS
Tabla 1A. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias no fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.
(Tabla 1, NCCLS Vol.22, Nº1 Enero 2002)
Enterobacteriaceae
Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
GRUPO A
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina
Ceftazidima
Oxacilina
Penicilina o
ampicilina
Ceftazolina
Cefalotina
Gentamicina
Penicilina
Gentamicina
Mezlocilina o
Ticarcilina
Piperacillin
GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO
Amikacina
Amikacina
Azithromicina o clarithromicina o
Eritromicina
Linezolid
Amoxicilina /ácido clavulánico o ampicilina /sulbactam
Piperacilina / tazobactam
Ticarcilina / ácido clavulánico
Aztreonam
Cefoperazona
Quniupristin-Dalfopristin
Linezolid
Vancomicina
Cefamandole o Cefonicid o Cefuroxime
Clindamicina
Cefepime
Cefepime
Trimetoprim/ sulfametathoxazole
Cefmetazole
Cefoperazone
Cefotetan
Cefoxitin
Ciprofloxacina
Vancomicina
Cefotaxima
Ceftizoxima
Ceftriaxona
Imipenem o
Meropenem
Ciprofloxacina o
Levofloxacina
Tobramicnina
Imipenen o Meropenen
Mezlocilina o
Piperacilina / Ticarcilina
Trimetropin / Sulfametoxasol
GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO
Enterobacteriaceae
Pseudomona aeruginosa y acinetobacter spp
Staphylococcus spp
Enterococcus spp
Aztreonam
Ceftazidima ( ambos indicadores útiles de β-Lactámicos de espectro extendido)
Cefotaxima o Ceftriazona
Cloranfenicol
Gentamicina ( solo para detección de resistencia de alto nivel)
Cloranfenicol
Cloranfenicol
Metilmicina
Estreptomicina (solo para deteccion de resistencia de alto nivel)
Kanamicina
Trimetropin / Sulfametoxazol
Ciprofloxacina o Levofloxacina o Ofloxacina o Gentifloxacina
Metilmicina
Gentamicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Tetraciclina
Rifampicina
(pueden ser probados para Enterococcus resistentes a vancomicina)
Tetraciclina
Rifampicina
Tobramicina
Tetraciclina
GRUPO U
SUPLEMENTARIO
SOLO TRACTO URINARIO
Carbenicilina
Carbenicilina
Lomefloxacina o
Norfloxacina
Ciprofloxacina
Levofloxacina
Norfloxacina
Cinoxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Ofloxacina
Ceftizoxima
Nitrofurantoina
Nitrofurantoina
Gatifloxacina
Loracarbef
Nitrofurantoina
Levofloxacina o
Lomefloxacina o
Norfloxacina o
Orfloxacina
Sulfisoxasole
Tetraciclina
Sulfisoxasole
Sulfisoxasole
Trimetropin
Trimetropin
Tetraciclina
Tabla 2. Grupos de antimicrobianos aprobados por la FDA para ser utilizados en las pruebas de rutina en bacterias fastidiosas en Laboratorios de Microbiología Clínica.
Haemophilus spp.
Neisseria gonorrhoeae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus spp.
distinto que
Streptococcus
pneumoniae
GRUPOA
PRIMARIO
PRUEBA E INFORME
Ampicilina
Eritromicina
Eritromicina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
Penicilina (disco de oxacilina)
Penicilina o ampicilina
Trimetoprim / sulfamethoxazole
GRUPO B
PRUEBA PRIMARIA
INFORME SELECTIVO
Cefotaxima o ceftazidima o ceftizoxima o ceftriaxona
Clindamicina
Gatifloxacino o levofloxacina
Moxifloxacino o sparfloxacina
Ofloxacina
Cloranfenicol
Cefuroxima sódica (parenteral)
Tetraciclina
Clindamicina
Meropenem
Cloranfenicol
Meropenem
Vancomicina
Vancomicina
GRUPO C
SUPLEMENTARIO
INFORME SELECTIVO
Azitromicina o claritromicina
Cefixima o cefotaxima o cefpodoxima o ceftizoxima o ceftriaxona
Cloranfenicol
Aztreonam
Linezolid
Cefaclor o cefprozil o loracarbef
Cefdinir o Cefixima o Cefpodoxima
Cefmetazole
Cefotetan
Cefoxitin
Cefuroxima
Rifampicina
Levofloxacina
Ofloxacina
Cefonicid
Linezolid
Acetil cefuroxima (oral)
Ciprofloxacina o grepafloxacina o ofloxacina
Quinupristin-Dalfopristin
Ciprofloxacina
Gatifloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Moxifloxacino
Ofloxacina
Esparfloxacina
Penicilina
Imipenen
Espectinomicina
Rifampicina
Tetraciclina
Tetraciclina
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